Volume1

418 Часть 2. Основные генетические механизмы

что самокорректирующаяся полимераза не может начинать синтез цепей de novo, подразумевает также, что фермент, который начинает цепи сызнова, не может быть эффективен в плане самокоррекции. Таким образом, любой фермент, который начинает синтез фрагментов Оказаки, будет неизбежно делать относительно неточную копию (по крайней мере 1 ошибку на 105 нуклеотидов). Даже если бы такие копии, остающиеся в конечном продукте, составляли не более 5 % всего генома (например, 10 нуклеотидов на 200-нуклеотидный фрагмент ДНК), то обусловленное этим возрастание общей частоты мутаций было бы огромным. Поэтому кажется весьма вероятным, что использование РНК, а не ДНК в качестве затравки дает клетке колоссальное преимущество: рибонуклеотиды в затравке автоматически помечаются как «подозрительные копии», чтобы их эффективно удалить и заменить.

5.2.6.  Расплетать двойную спираль ДНК перед репликационной вилкой помогают специальные белки

Для планомерного протекания синтеза ДНК двойная спираль ДНК перед репликационной вилкой должна быть расплетена, с тем чтобы дезоксирибонуклеозидтрифосфаты могли образовывать пары оснований с матричной нитью. Однако двойная спираль ДНК очень устойчива в физиологических условиях; пары оснований закреплены на своих местах столь прочно, что необходимы температуры, близкие к точке кипения воды, чтобы разделить две комплементарные цепи в условиях in vitro. Поэтому, чтобы двойная спираль раскрылась и одноцепочечная ДНК стала доступной для копирования ДНК полимеразой, необходимы особые белки. Они бывают двух типов: ДНК-хеликазы

и белки, связывающие одноцепочечную ДНК. ДНК-хеликазы были сначала выделены как белки, которые гидролизуют ATP при связывании с одноцепочечными ДНК. Как было

описано в главе 3, гидролиз ATP может ци-

клически изменять форму молекулы белка, что позволяет белку производить механическую работу. ДНК хеликазы используют этот принцип, чтобы быстро продвигаться по одинарной

нити ДНК. Наталкиваясь на область двой-

ной спирали, они продолжают продвигаться по своей цепи и таким образом расклинивают спираль со скоростью до 1 000 пар нуклеотидов в секунду (рис. 5.14 и 5.15).

Рис. 5.14. Опыт для проверки ферментативной актив-

ности ДНК-хеликаз. Короткий фрагмент ДНК отжигается сдлиннойцепьюДНК—чтобысформироватьнебольшую областьдвойнойспиралиДНК.Двойнаяспиральплавится по мере того, как хеликаза продвигается по одинарной нитиДНК,высвобождаякороткийфрагментДНКвходереакции,дляосуществлениякоторойнеобходимоналичие ибелкахеликазы,иATP.Быстроескачкообразноедвижениехеликазыобеспечиваетсягидролизомсвязанныхсней молекулATP(см.рис.3.77).МногиеДНК-хеликазысостоят изшестисубъединиц,какэтопоказанонасхеме.

Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 421

5.2.7.  Скользящее кольцо удерживает движущуюся ДНК полимеразу на ДНК

В большинстве своем молекулы ДНК-полимеразы сами по себе успевали бы синтезировать лишь короткую цепочку нуклеотидов и сразу бы срывались с матрицы ДНК. Стремление быстро отделиться от молекулы ДНК позволяет молекуле ДНКполимеразы, которая только что закончила синтезировать один фрагмент Оказаки на отстающей нити, вновь быстро быть пущенной в оборот и начать синтез следующего фрагмента Оказаки на той же нити. Такая высокая скорость диссоциации, однако, мешала бы полимеразе синтезировать длинные цепи ДНК в репликационной вилке, если бы не было вспомогательного белка, который выполняет роль регулирующего скользящего зажима (sliding clamp). Этот зажим прочно удерживает полимеразу на ДНК, когда она передвигается, но отпускает ее, как только полимераза наталкивается на двухцепочечную область ДНК.

Каким образом скользящий зажим может препятствовать полимеразе диссоциировать и в то же время не создает помех быстрому продвижению полимеразы по молекуле ДНК? Трехмерная структура белка-зажима, определенная с помощью рентгенодифракционного анализа, показывает, что он образует большое кольцо вокруг двойной спирали ДНК. Одна сторона кольца связана позади ДНК-полимеразы, а все кольцо свободно скользит по ДНК вместе с перемещающейся полимеразой. Сборка зажима вокруг ДНК требует гидролиза ATP, что осуществляет специальный белковый комплекс, погрузчик, или установщик зажима (clump loader): он гидролизует ATP,

когда «насаживает» зажим в месте соединения затравки с матрицей (рис. 5.18). На матрице ведущей нити движущаяся ДНК-полимераза прочно связана

с зажимом, и так они остаются связанными долгое время. На матрице отстающей нити ДНК-полимераза также использует зажим, но каждый раз, достигая 5′-конца предыдущего фрагмента Оказаки, полимераза освобождается от зажима и отделяется от матрицы. Далее эта молекула полимеразы связывается с новым зажимом, собранным на РНК-затравке следующего фрагмента Оказаки.

5.2.8.  Белки в репликационной вилке действуют сообща, образуя настоящую репликационную машину

Хотя мы рассматривали репликацию ДНК так, как если бы она выполнялась смесью белков, работающих независимо один от другого, в действительности большинство белков объединено в крупный и упорядоченный мультиферментный комплекс, который быстро синтезирует ДНК. Этот комплекс может быть уподоблен крошечной швейной машине, состоящей из белковых узлов и приводимой в действие энергией, вырабатываемой посредством гидролиза нуклеозидтрифосфата. Подобно швейной машине, репликационный комплекс, вероятно, остается неподвижным относительно своего непосредственного окружения; ДНК можно рассматривать как длинную полоску ткани, быстро протягиваемую через нее. Хотя репликационный комплекс наиболее интенсивно изучался у E. coli и нескольких из поражающих ее вирусов, у эукариот, как мы увидим чуть позже, работает во многом схожий комплекс.

На рис. 5.19, а представлена вся совокупность функций, выполняемых субъединицами репликационной машины. Находящаяся перед репликационной вилкой ДНК-хеликаза расплетает спираль ДНК. В самой вилке — одна на опережающей нити, другая на отстающей нити — работают две молекулы ДНК-полимеразы. Тогда как молекула ДНК-полимеразы на ведущей нити может работать непрерывно,

424 Часть 2. Основные генетические механизмы

молекула ДНК-полимеразы на отстающей нити должна начинать свою работу вновь и вновь через короткие промежутки времени, используя короткую РНК-затравку, тут же изготавливаемую молекулой ДНК-праймазы. Тесное сотрудничество всех этих белковых компонентов увеличивает эффективность репликации и становится возможным благодаря определенной укладке отстающей нити «петлей назад», как показано на рис. 5.19, а. Кроме того, такая организация облегчает установку зажима полимеразы при каждом цикле синтеза фрагмента Оказаки: погрузчик зажима и молекула ДНК-полимеразы на отстающей нити остаются на своих местах как часть белковой машины, даже когда они отделяются от своей матрицы ДНК. Репликационные белки, таким образом, связаны друг с другом в единый большой комплекс (полная молекулярная масса > 106 дальтон), что позволяет ДНК синтезироваться по обе стороны репликационной вилки согласованно и эффективно.

На отстающей нити реплицирующая ДНК машина оставляет позади себя ряд фрагментов Оказаки с незаделанными зазорами между ними, которые на своих 5′-концах все еще содержат РНК, которая затравливала их синтез. Эта РНК удаляется, и образующийся зазор заделывается ферментами репарации ДНК, которые работают позади репликационной вилки (см. рис. 5.12).

5.2.9.  Ошибки репликации, которые допускает репликационная машина, удаляет направляемая цепью система исправления ошибок спаривания

Как было сказано ранее, бактерии наподобие E. coli способны делиться один раз каждые 40 минут, благодаря чему имеется возможность сравнительно легко проводить массовый анализ больших популяций, чтобы найти редкую мутантную клетку, видоизменившуюся в определенном процессе. Представители одного интересного класса мутантов содержат изменения в так называемых генах-мутаторах, которые значительно увеличивают частоту самопроизвольных мутаций. Не удивительно, что один такой мутант производит дефектную форму 3′ → 5′ корректирующей экзонуклеазы, которая является частью фермента ДНК-полимеразы (см. рис. 5.8 и 5.9). Мутантная ДНК-полимераза не может эффективно корректировать ДНК, и многие ошибки репликации, которые в ином случае были бы удалены, накапливаются в ДНК.

Изучение других мутантов E. coli, проявляющих аномально высокую частоту мутаций, выявило систему коррекции неправильного спаривания (mismatch proofreading system), которая удаляет ошибки репликации, допущенные полимеразой и пропущенные корректирующей экзонуклеазой. Такая направляемая цепью система исправления ошибок спаривания (strand-directed mismatch repair) вы-

являет потенциальные места искажений в спирали ДНК, что обусловлено плохой «подгонкой» оснований некомплементарных друг другу.

Если бы такая корректирующая система попросту узнавала ошибки спаривания

внедавно реплицированной ДНК и случайным образом исправляла один из двух несоответствующих друг другу нуклеотидов, то точно в половине случаев она ошибочно «исправляла» бы исходную матричную нить, приводя ее в соответствие ошибке, и, таким образом, средняя частота появления ошибок ничуть не снизилась бы. Чтобы быть эффективной, такая корректирующая система должна различать и удалять несоответствующий нуклеотид только на вновь синтезированной нити,

вкоторой и произошла ошибка репликации.

Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 425

У E. coli механизм различения нитей, используемый системой исправления ошибок спаривания, связан с метилированием определенных остатков А в ДНК. Метильные группы присоединяются ко всем остаткам А в последовательности GATC, но лишь по прошествии некоторого времени после включения А в новосинтезированную цепь ДНК. В результате неметилированные последовательности GATC встречаются только в новосинтезированных нитях сразу после репликационной вилки. Распознавание таких неметилированных последовательностей GATC позволяет в течение короткого периода отличать новые нити ДНК от старых, что и требуется для избирательного удаления ошибок, допущенных именно при репликации. Состоящий из трех этапов процесс включает в себя распознавание ошибки спаривания, вырезание сегмента ДНК, содержащего эту ошибку, из новосинтезированной нити и повторный синтез вырезанного сегмента с использованием старой нити в качестве шаблона. Такая направляемая нитью система корректировки еще в 100 раз уменьшает число ошибок, допущенных в ходе репликации ДНК (см. таблицу 5.1, стр. 414).

Подобная система коррекции ошибок спаривания несет свою службу и в клетках человека (рис. 5.20). Вся значимость этой системы становится очевидной при

Рис. 5.20. Модель направляемого цепью исправления ошибок спаривания у эукариот. а) Два изо-

браженныхбелкаприсутствуюткакубактерий,такивклеткахэукариот:MutSспецифичносвязывается с комплементарными основаниями, тогда как MutL просматривает близлежащую ДНК на предмет наличия разрыва. Как только MutL находит разрыв, он запускает деградацию разорванной нити на всем протяжении несоответствия оснований принципу комплементарности. Поскольку у эукариот разрывы главнымобразомвозникаютвпределахновореплицированныхнитейДНК,тоошибкирепликацииудаляются избирательно. У бактерий механизм тот же самый, за исключением того, что дополнительный белок в комплексе (MutH), проиллюстрированный на данной схеме. б) Структура белка MutS, задача которого убрать ошибки на ДНК. Этот белок представляет собой димер, который, как показано, захватываетдвойнуюспиральДНК,образуяпетлюДНКвобластинекомплементарныхоснований.Кажется, что белок MutS «просматривает» ДНК, ища ошибки путем проверки наличия участков, которые могут бытьлегкосогнуты,потомучтосоставляющиеееоснованиянеобразуютнормальнойкомплементарной пары.(ИзображениебзаимствованоизG. Obmolovaetal.,Nature407:703–710,2000.Слюбезногораз-

решенияиздательстваMacmillanPublishersLtd.)

426 Часть 2. Основные генетические механизмы

взгляде на особей, которые унаследовали одну дефектную копию гена исправления ошибок спаривания (наряду с функционально активным геном на другой копии хромосомы). Такие люди имеют выраженную предрасположенность к некоторым типам рака. Например, при разновидности рака кишечника, называемого наслед-

ственный неполипозный колоректальный рак (HNPCC), самопроизвольная мутация второго, функционально активного, гена производит клон соматических клеток, которые, поскольку в них не выполняется коррекция неправильного спаривания, накапливают мутации необычайно быстро. Большинство видов рака возникает в клетках, которые накопили множественные мутации (см. рис. 20.11), и поэтому клетки, лишенные возможности исправлять ошибки репликации, имеют все основания стать злокачественными. К счастью, большинство из нас наследует обе доброкачественные копии гена, который кодирует белок коррекции неправильного спаривания; и это защищает нас, так как очень мала вероятность того, что в одной клетке мутируют сразу обе копии.

В клетках эукариот механизм распознавания новосинтезированной цепи от родительской матричной в месте неправильного спаривания не зависит от метилирования ДНК. И в самом деле, у некоторых эукариот — в их числе дрожжи и дрозофила — не происходит метилирования ДНК. Недавно синтезированная ДНК отстающей нити непродолжительное время имеет надрезы (прежде чем они будут зашиты ДНК-лигазой), и биохимические эксперименты показывают, что такие надрезы (называемые одноцепочечными разрывами) являются сигналом, который нацеливает систему коррекции неправильного спаривания на должную нить (см. рис. 5.20). Логично предположить, что для работы такой системы также необходимо, чтобы вновь синтезированная ДНК на ведущей нити имела кратковременные разрывы — как это происходит, пока еще не ясно.

5.2.10.  Спутывание ДНК во время репликации предотвращают ДНК топоизомеразы

При продвижении репликационной вилки по двунитевой ДНК возникает проблема, которая получила название «проблемы закручивания» (winding problem) ДНК. Дело в том, что каждые 10 пар нуклеотидов, реплицированных в вилке, соответствуют одному полному обороту вокруг оси родительской двойной спирали; поэтому, для того чтобы репликационная вилка могла двигаться, вся хромосома перед вилкой должна была бы вращаться с большой скоростью (рис. 5.21). В случае длинных хромосом это потребовало бы большого количества энергии, и поэтому тут используется альтернативная стратегия: в спирали ДНК образуется шарнир, который формируют белки, известные под названием

ДНК-топоизомераз.

ДНК топоизомераза может рассматриваться как обратимая нуклеаза, которая сама ковалентно соединяется с фосфатом основной цепи ДНК и таким образом разрывает фосфодиэфирную связь в нити ДНК. Эта реакция обратима, и фосфодиэфирная связь вновь образуется, как только белок уходит.

Топоизомераза первого типа, названная топоизомеразой I, производит временный однонитевой разрез; этот разрыв фосфодиэфирной связи в сахарофосфатном остове позволяет двум отрезкам спирали ДНК по обе стороны надреза свободно вращаться друг относительно друга, используя фосфодиэфирную связь в противоположной надрезу нити в качестве шарнира для вращения (рис. 5.22). Любое

Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 427

Рис.5.21.ПроблемазакручиванияДНК,которая возникает в ходе репликации. У бактерий для продвижениярепликационнойвилкисоскоростью 500 нуклеотидов в секунду материнская спираль ДНК перед этой вилкой должна вращатьсясчастотой50оборотоввсекунду.

напряжение в спирали ДНК будет осуществлять такое вращение в направ-

лении, снижающем это напряжение. В результате репликация ДНК может

идти своим чередом при вращении только короткого отрезка спирали — части, лежащей сразу перед вилкой.

Поскольку ковалентная связь, которая соединяет белок ДНК-топоизомеразу

с фосфатом в цепи ДНК, сохраняет в себе энергию расщепленной фосфодиэфирной связи, ее лигирование (т. е. реакция «сшивания») происходит быстро и не требует дополнительной энергетической подпитки. В данном

отношении этот механизм воссоединения фосфодиэфирной связи отличается от катализируемого ферментом ДНК-лигазой, о котором мы говорили раньше (см.

рис. 5.13).

ДНК-топоизомераза второго типа, топоизомераза II, образует ковалентную связь одновременно с обеими цепями спирали ДНК, производя временный двухцепочечный разрыв в спирали. Эти ферменты активируются на хромосомах в участках, где две двойные спирали пересекают друг друга. Как только молекула топоизомеразы II связывается с таким участком пересечения, она тут же использует гидролиз ATP, чтобы эффективно выполнить следующий набор реакций: 1) обратимо разорвать одну двойную спираль, чтобы создать в ней «ворота»; 2) заставить вторую, близлежащую, двойную спираль пройти через эти «ворота» и 3) после этого запечатать разрыв («закрыть ворота») и отделиться от ДНК (рис. 5.23). Таким вот образом ДНК-топоизомеразы типа II могут эффективно разделять два сцепленных кольца ДНК (рис. 5.24).

Та же реакция предотвращает также серьезные проблемы спутывания ДНК, которые в противном случае возникали бы в ходе репликации ДНК. Эту функцию прекрасно иллюстрируют мутантные клетки дрожжей, которые производят вместо нормальной топоизомеразы II вариант, который инактивируется при температуре выше 37 °C. Когда мутантные клетки нагревают до этой температуры, их дочерние хромосомы остаются переплетенными после репликации ДНК и не могут отделиться одна от другой. Огромную пользу топоизомеразы II как инструмента для распутывания хромосом сможет в полной мере оценить лишь тот, кому хоть раз приходилось биться над неожиданно объявившейся на рыболовной леске «бородой», не имея ножниц под рукой.