Volume1

408 Часть 2. Основные генетические механизмы

3·109 пар нуклеотидов) изменяется предположительно лишь на 3 нуклеотида при каждом делении клетки. Это позволяет большинству людей передавать точные генетические инструкции от одного поколения другому, равно как и избегать изменений в соматических клетках, которые могли бы привести к раку.

5.2.  Механизмы репликации ДНК

Все организмы перед каждым делением клетки должны дублировать свою ДНК с исключительной точностью. В этом параграфе мы исследуем, как замысловатая «репликационная машина» достигает такой точности, причем при скорости удвоения ДНК 1 000 нуклеотидов в секунду.

5.2.1.  В основе процессов репликации и репарации ДНК лежит принцип комплементарности оснований

Как уже было упомянуто в главе 1, матричный синтез ДНК — это механизм, используемый клеткой, чтобы копировать нуклеотидную последовательность одной цепи ДНК в комплементарную последовательность ДНК (рис. 5.2). Этот процесс связан с узнаванием каждого нуклеотида матричной нити ДНК (шаблона) свободным (неполимеризованным) комплементарным нуклеотидом, и это требует отделения двух цепей спирали ДНК друг от друга. В результате такого расхождения цепей донорные и акцепторные группы водородных связей, расположенные на образующих ДНК основаниях, становятся доступными для спаривания с соответствующими свободными нуклеотидами, из числа поступивших «в зону проведения работ», — для осуществления катализируемой ферментом полимеризации в новую цепь ДНК.

Первый полимеризующий нуклеотиды фермент, а именно ДНК-полимераза, был открыт в 1957 г. Тогда же было установлено, что свободные нуклеотиды, служащие субстратами для этого фермента, представлены дезоксирибонуклеозидтрифосфатами, а для их полимеризации в ДНК необходима одноцепочечная матрица ДНК. На рис. 5.3 и 5.4 представлен ступенчатый механизм такой реакции.

Рис. 5.2. Двойная спираль ДНК служит матрицей для своей собственной дупликации. Поскольку нуклеотид А спаривается лишь с T, а G — только с C, каждая из цепей ДНК может служить матрицей, определяющейпоследовательностьнуклеотидоввкомплементарнойейнитипутемспариванияоснований. Благодаря такому механизму двухцепочечная молекула ДНК может копироваться с большой точностью.

Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 409

Рис. 5.3. Химия синтеза ДНК. Присоединение дезоксирибонуклеотида к 3'-концу полинуклеотидной цепи (затравочная цепь) — основополагающая реакция, посредством которой и синтезируется ДНК. Как показано на рисунке, спаривание оснований между подошедшим к «месту действия» дезоксирибонуклеозидтрифосфатом и существующей цепью ДНК (матричная цепь) определяет формирование новойцепиДНКскомплементарнойнуклеотиднойпоследовательностью.

5.2.2.  Репликационная вилка ДНК асимметрична

В ходе репликации ДНК в клетке каждая из двух исходных цепей ДНК служит матрицей для формирования полноразмерной новой цепи. Поскольку каждая из двух «дочерей» делящейся клетки наследует новую двойную спираль ДНК, содержащую одну исходную и одну новую цепи (рис. 5.5), говорят, что двойная спираль ДНК реплицируется ДНК-полимеразой «полуконсервативно». Как же свершается сие таинство?

Исследования, выполненные в начале 1960-х гг. на целых реплицирующихся хромосомах, показали наличие ограниченной зоны репликации, которая поступательно перемещается по двойной спирали родительской ДНК. В силу Y-образной формы этой активной области ее называют репликационной, или репликативной, вилкой (рис. 5.6). В зоне репликационной вилки многоферментный комплекс, который содержит ДНК-полимеразу, синтезирует ДНК обеих новых дочерних нитей.

410 Часть 2. Основные генетические механизмы

Рис.5.4.СинтезДНК,катализируемыйДНК-полимеразой.а)Какпоказанонарисунке,ДНК-полимераза катализируетпошаговоеприсоединениедезоксирибонуклеотидовк3'-OHконцуполинуклеотиднойцепи, такназываемойзатравочнойцепи,котораяспаренасовторой,матричной,цепью.Новосинтезированная нить ДНК поэтому полимеризуется в направлении 5' → 3', как показано на предыдущем рисунке. Посколькукаждыйприбывающийдезоксирибонуклеозидтрифосфатдолженспаритьсясматричнойнитью, чтобы быть опознанным ДНК-полимеразой, то эта нить и определяет, который из четырех возможных дезоксирибонуклеотидов(A,C,GилиT)будетприсоединен.Реакцияосуществляетсязасчетзначительного по величине благоприятного изменения свободной энергии, что обусловлено высвобождением пирофосфата с последующим гидролизом до двух молекул неорганического фосфата. б) Форма моле- кулыДНК-полимеразы,определеннаярентгеноструктурныманализом.Грубоговоря,ДНК-полимеразы напоминаютправуюруку,вкоторойладонь,пальцыибольшойпалец1 «захватывают»ДНКиобразуют активныйучасток(сайт).Визображеннойпоследовательностиправильноерасположениеприбывшегок местудействиядезоксинуклеозидтрифосфатапобуждаетпальцыполимеразысомкнуться,чтоинициирует реакцию присоединения нуклеотида. Диссоциация пирофосфата вызывает размыкание пальцев и перемещение (транслокацию) ДНК на один нуклеотид, так что активный участок полимеразы готов принятьследующийдезоксинуклеозидтрифосфат.

Первоначально простейший механизм репликации ДНК представляли как непрерывное наращивание обеих новых цепей, нуклеотид за нуклеотидом, в репликационной вилке, по мере того как она перемещается от одного конца молекулы ДНК к другому. Но в силу антипараллельной ориентации двух цепей ДНК в двойной спирали (см. рис. 5.2) при таком механизме одна дочерняя нить должна была бы полимеризоваться в направлении 5′ → 3′, а вторая — в направлении 3′ → 5′. Для такой репликационной вилки потребовалось бы два разных типа фермента ДНКполимеразы. Однако все множество ДНК-полимераз, которые открыты к настоящему времени, может осуществлять синтез лишь в направлении 5′ → 3′.

Как же в таком случае наращивается цепь ДНК в направлении 3′ → 5′? Сначала ответ предложили на основании результатов эксперимента, выполненного

вконце 1960-х гг. Исследователи добавили радиоактивный 3H-тимидин к делящимся бактериям на несколько секунд, чтобы радиоактивная метка попала только

вДНК, реплицированную позже всех, то есть находящуюся сразу за репликаци-

1 Оригинальное название — наладонник. — Прим. пер.

412 Часть 2. Основные генетические механизмы

Рис. 5.7. Структура репликационной вилки ДНК. Поскольку обе цепи дочерней ДНК полимеризуются

внаправлении 5' → 3', ДНК, синтезируемая на отстающей нити, должна изначально синтезироваться

ввидерядакороткихмолекулДНК,названныхфрагментамиОказаки.ФрагментыОказакисинтезируютсянаотстающейнитипоследовательно,приэтомчемониближеквилке,тем«новее».

Например, с маленькими изменениями в геометрии спирали между G и T в ДНК могут образовываться две водородные связи. Кроме того, кратковременно возникают редкие таутомерные формы четырех оснований ДНК в отношении 1 на 104 или 105. Такие формы ошибочно образуют пару, не нарушая при этом геометрии спирали: например, редкая таутомерная форма C спаривается не с G, а с А.

Если бы ДНК-полимераза не предпринимала никаких специальных действий, когда происходит ошибочное спаривание между прибывшим дезоксирибонуклеозидтрифосфатом и матрицей ДНК, то в новую цепь ДНК зачастую включался бы неправильный нуклеотид, что приводило бы к частому возникновению мутаций. Однако высокая точность репликации ДНК зависит не только от изначального спаривания оснований, но также и от нескольких «корректирующих» механизмов, которые последовательно работают над исправлением ошибочных пар, периодически возникающих в новом поколении ДНК.

Первый этап коррекции ДНК-полимераза выполняет непосредственно перед тем, как новый нуклеотид присоединяется к наращиваемой цепи. Наши знания об этом механизме получены в ходе исследований нескольких различных ДНК-полимераз, а в их числе и одной производимой бактериальным вирусом T7, который реплицируется в E. coli. Нужный нуклеотид имеет более высокое сродство к движущейся полимеразе, чем неверно выбранный, потому что правильное спаривание благоприятнее

вэнергетическом отношении. Более того, после связывания нуклеотида, но прежде чем нуклеотид ковалентно присоединится к растущей цепи, фермент должен претерпеть конформационное изменение, в результате которого его «пальцы» сжимаются вокруг активного участка (см. рис. 5.4). Поскольку такое изменение легче происходит при правильном, чем при неправильном спаривании оснований, это позволяет полимеразе выполнять «двойную проверку» точной геометрии пары оснований, прежде чем она решится катализировать присоединение нуклеотида к цепи.

Следующая исправляющая ошибки реакция, известная как экзонуклеолити- ческая коррекция (exonucleolytic proofreading), имеет место незамедлительно после тех редких случаев, когда неверный нуклеотид все-таки ковалентно присоединяется к растущей цепи. Ферменты ДНК-полимеразы являются чрезвычайно разборчивыми

вотношении типов цепей ДНК, которые они удлиняют: они безапелляционно требуют заранее сформированного, спаренного с матрицей 3′-OH-конца затравочной цепи, или праймера (primer strand; см. рис. 5.4). Те молекулы ДНК, что несут некомплементарный (ошибочно спаренный) нуклеотид на 3′-OH-конце затравочной цепи, не

414 Часть 2. Основные генетические механизмы

Рис.5.9.Редактирование(editing)репликацииДНК-полимеразой.ОбщаясхемаструктурыДНК-полимеразы вкомплексесматрицейДНК:врежимеполимеризации(слева)иврежимередактирования,иликоррекции (справа).Обозначеныкаталитическиесайтыдляэкзонуклеолитическойреакции(E)иреакцииполимеризации(P).ВрежимередактированияновосинтезированнаяДНКкратковременноотходитотматрицыиполимеразапретерпеваетконформационноеизменение,врезультатекоторогокорректирующийкаталитическийучасток занимаетдругоеположение,гдеипроисходитудалениепоследнегоизприсоединенныхнуклеотидов.

генов, не нуждаются в таком эффективном экзонуклеолитическом корректирующем механизме: ошибки, возникающие при создании РНК, не передаются следующему поколению, и случайная дефектная молекула РНК, которая произведена, не имеет никакого значения в долгосрочной перспективе. Поэтому РНК-полимеразы способны начинать синтез новых полинуклеотидных цепей без затравки.

Как в процессе синтеза РНК, так и в самостоятельном процессе — трансляции последовательностей мРНК в последовательности белков — частота появления ошибок составляет около одной ошибки на каждые 104 событий полимеризации. Такой коэффициент ошибок в 100 000 раз больше, чем при репликации ДНК, в каковом случае ряд корректирующих процессов обеспечивает необычайную точность работы (таблица 5.1).

Таблица5.1.Триэтапа,обеспечивающихвысокуюточностьсинтезаДНК

Примечание: третий этап — направляемое цепью исправление ошибок спаривания — описан ниже в этой главе.

5.2.4.  Эффективное исправление ошибок возможно лишь при репликации ДНК в направлении 5' →3'

Причина, по которой репликация ДНК происходит исключительно в направлении 5′ → 3′, объясняется, вероятно, необходимостью получения на выходе «качественного продукта». Если бы существовала ДНК-полимераза, которая присоединяла бы дезоксирибонуклеозидтрифосфаты в направлении 3′ → 5′, то активи-

Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 415

рующий трифосфат, необходимый для образования ковалентной связи, обеспечивал бы наращиваемый 5′-конец цепи, а не присоединяемый мононуклеотид. В таком случае ошибки полимеризации попросту не могли бы исправляться гидролизом, потому что голый 5′-конец цепи, созданный таким образом, немедленно завершил бы синтез ДНК (рис. 5.10). Поэтому исправить несоответствующее основание

Рис.5.10.ОбъяснениефактанаращиванияцепиДНКвнаправлении5'→3'.Роствнаправлении5'→3',

представленный справа, позволяет цепи продолжать расти, после того как ошибка в полимеризации удалена экзонуклеолитической коррекцией (см. рис. 5.8). Напротив, экзонуклеолитическая коррекция в гипотетической схеме полимеризации в направлении 3' → 5', помещенной слева, блокировала бы дальнейшееудлинениецепи.ДляудобствапоказанатолькозатравочнаянитьдвойнойспиралиДНК.