Volume1

398 Часть 2. Основные генетические механизмы

В силу чрезвычайно высокой точности процессов репликации и репарации ДНК случайные ошибки в последовательностях нуклеотидов в геномах происходят

настолько редко, что только приблизительно один нуклеотид из 1 000 изменяется

каждый миллион лет в любой отдельно взятой последовательности поколений. Поэтому неудивительно, что сравнение хромосом человека и шимпанзе — кото- рых разделяет примерно 6 миллионов лет эволюции, — показывает очень немного изменений. Мало того что наши гены, по существу, одни и те же, но и их порядок

на всех хромосомах почти одинаков. Хотя за минувшие 6 миллионов лет произо-

шло значительное число сегментных дупликаций и сегментных делеций, но даже позиции мобильных генетических элементов, которые составляют основную долю нашей некодирующей ДНК, в большинстве своем не изменились.

При сравнении геномов двух менее родственных организмов — например,

человека и мыши, отделенных друг от друга примерно 80 миллионами лет, — об- наружено намного больше изменений. Сегодня результаты работы естественного

отбора заметны невооруженным глазом: проходя горнило очищающего отбора,

жизненно важные последовательности нуклеотидов — как в регуляторных

областях, так и в кодирующих последовательностях (последовательности

экзонов) — были в высшей степени консервативны. Напротив, не представ- ляющие особого значения последовательности (например, бóльшая часть ДНК

в интронах) изменились до такой степени, что точное выравнивание согласно

родословной зачастую оказывается невозможным.

Благодаря очищающему отбору сравнение последовательностей геномов

множества родственных видов является особенно действенным способом поиска последовательностей ДНК с жизненно важными функциями. Хотя около 5 %

генома человека осталось консервативным в результате очищающего отбора,

функции основной массы этой ДНК (десятки тысяч многовидовых консерва-

тивных последовательностей) продолжают оставаться необъяснимой тайной.

Грядущие эксперименты по выяснению их функции должны преподать нам многое о биологии позвоночных.

Сравнение других последовательностей показывает, что огромная генети-

ческая сложность современных организмов обусловлена расширением древних

семейств генов. Ясно, что главным источником генетической новизны в ходе эволюции была дупликация ДНК, сопровождающаяся дивергенцией последова- тельностей. Геномы любых двух человек будут отличаться друг от друга как из-за замен нуклеотидов (полиморфизмов отдельных нуклеотидов, или SNP),

так и из-за унаследованных приобретений ДНК и потерь ДНК, которые влекут

за собой изменения в числе копий. Понимание этих различий пойдет на пользу и медицине, и нашему осмыслению биологии человека.

Задачи

Какие утверждения являются верными? Обоснуйте свой ответ

4.1.У женщин имеется 23 различные хромосомы, а у мужчин — 24.

4.2.При сравнении ДНК родственных организмов, таких как человек и мышь, идентификация консервативных последовательностей ДНК облегчает поиск функционально значимых областей.

4.3.Четыре стержневых гистона представляют собой относительно маленькие белки с очень высокой долей положительно заряженных аминокислот; положитель-

400 Часть 2. Основные генетические механизмы

мировании структуры хроматина. Три белка, специфических для человека: HPlα, HPlβ и HPlγ,— делят между собой высококонсервативный хромодомен, который, как думают, определяет локализацию гетерохроматина. Для того чтобы определить, могут ли эти белки связываться с N-концом гистона H3, вы ковалентно присоединили к гранулам сорбента различные варианты N-концевого пептида H3: немодифицированного, Lys-9-диметилированного (K9 Me) или Ser 10 фосфорилированного (S10-P), — наряду с немодифицированным хвостом гистона H4. Такая конструкция позволяет вам инкубировать каждый вид полученных гранул с различными белками, смывать несвязавшиеся белки и затем элюировать связанные с гранулами белки для последующего анализа всех полученных фракций посредством вестерн-блоттинга. Результаты вашего «pull-down» анализа (разновидность аффинной хроматографии, очень похожая на метод соосаждения с антителами, или ко-иммунопреципитацию, но вместо антител в данном случае используется «bait» protein — «белок-наживка». — Прим. ред.) для белков HP1 представлены на рис. Q4.3, наряду с результатами для нескольких контрольных белков, в том числе Pax5 (регуляторного белка), принадлежащего к семейству polycomb белка Pcl, который, как известно, связывается с гистонами, и Suv39hl — гистонметилтрансферазы.

На основании этих результатов скажите, которые из проанализированных белков связываются с немодифицированными хвостами гистонов? Связывается ли какой-либо из белков HP1 и контрольных белков избирательно с модифицированными N-концевыми пептидами гистонов? Какая модификация гистонов, по вашим предсказаниям, могла бы быть обнаружена в гетерохроматине?

4.14. Подвижные части ДНК — мобильные генетические элементы, — которые встраиваются в хромосомы и накапливаются в ходе эволюции, составляют более 40 % генома человека. Подвижные генетические элементы четырех типов: длинные рассеянные элементы (LINEs), короткие рассеянные элементы (SINEs), LTR-ретротранспозоны и ДНК-транспозоны — вставлены более или менее беспорядочно всюду по геному человека. Эти элементы заметно реже встречаются в четырех группах генов гомеобокс: HoxA, HoxB, HoxC и HoxD, как продемонстрировано на примере HoxD на рис. Q4.4, наряду с эквивалентной областью хромосомы 22, в которой отсутствует группа Hox. Каждая группа Hox имеет приблизительно 100 т. п. н. в длину и содержит от 9 до 11 генов, дифференциальная экспрессия которых вдоль передне-задней оси развивающегося эмбриона утверждает основное общее строение организма у людей (и у других животных). Почему, как вы полагаете, подвижные генетические элементы столь редки в группах Hox?

Рис. Q4.3. Анализ «pull-down», призванный определить специфичность связывания белков HP1 (к задаче 4.13). После разделения посредством электрофореза в полиакриламидномгелевприсутствиидодецилсульфатанатрия каждыйбелокслевабылобнаруженприпомощииммуноблоттинга с использованием специфических антител. Для N-концевого пептида каждого гистона обозначены поступивший на анализ белок (I), несвязавшийся (U) и связавшийсяcгрануламибелок(B).(ПереработаноизМ. Lachner et al., Nature 410: 116–120, 2001. С любезного разрешения MacmillanPublishersLtd.)

402 Часть 2. Основные генетические механизмы

Ried T., Schrock E., Ning Y. & Wienberg J. (1998) Chromosome painting: a useful art. Hum. Mol. Genet. 7: 1619–1626.

Robinson P. J. & Rhodes R. (2006) Structure of the 30 nm chromatin fibre: A key role for the linker histone. Curr. Opin. Struct. Biol. 16: 1–8.

Saha A., Wittmeyer J. & Cairns B. R. (2006) Chromatin remodeling: the industrial revolution of DNA around histones. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 7: 437–446.

Woodcock C. L. (2006) Chromatin architecture. Curr. Opin. Struct. Biol. 16: 213–220.

Регуляция на уровне структурной организации хроматина

Egger G., Liang G, Aparicio A. & Jones P. A. (2004) Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature 429: 457–463.

Henikoff S. (1990) Position-effect variegation after 60 years. Trends Genet 6: 422–426.

Henikoff S & Ahmad K (2005) Assembly of variant histones into chromatiin.

Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21: 133–153.

Gaszner M. & Felsenfeld G. (2006) Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nature Rev. Genet. 7: 703–713.

Hake S. B. & Allis C. D. (2006) Histone H3 variants and their potential role in indexing mammalian genomes: the “H3 barcode hypothesis”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 6428–6435.

Jenuwein T. (2006) The epigenetic magic of histone lysine methylation. FEBS J.

273:3121–3135.

Martin C. & Zhang Y. (2005) The diverse functions of histone lysine methylation.

Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6: 838–849.

Mellone B., Erhardt S. & Karpen G. H. (2006) The ABCs of centromeres. Nature Cell Biol. 8: 427–429.

Peterson C. L. & Laniel M. A. (2004) Histones and histone modifications. Curr. Biol. 14: R546–R551.

Ruthenburg A. J., Allis C. D. & Wysocka J. (2007) Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic mark. Mol. Cell 25: 15–30.

Shahbazian M. D. & Grunstein M. (2007) Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation. Annu. Rev. Biochem. 76: 75–100.

Организация хромосом

Akhtar A. & Gasser S. M. (2007) The nuclear envelope and transcriptional control.

Nature Rev. Genet. 8: 507–517.

Callan H. G. (1982) Lampbrush chromosomes. Proc. Roy. Soc. Lond. Ser. B 21: 417–448.

Chakalova L., Debrand E., Mitchel J. A. et al. (2005) Replication and transcription: shaping the landscape of the genome. Nature Rev. Genet. 6: 669–678.

Cremer T., Cremer M., Dietzel S. et al. (2006) Chromosome territories—a functional nuclear landscape. Curr. Opin. Cell Biol. 18: 307–316.

Ebert A., Lein S., Schotta G. & Reuter G. (2006) Histone modification and the control of heterochromatic gene silencing in Drosophila. Chromosome Res. 14: 377–392.

Fraser P. & Bickmore W. (2007) Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature 447: 413–417.

Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 403

Handwerger K. E. & Gall J. G. (2006) Subnuclear organelles: new insights into form and function. Trends Cell Biol. 16: 19–26.

Hirano T. (2006) At the heart of the chromosome: SMC proteins in action. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 7: 311–322.

Lamond A. I. & Spector D. L. (2003) Nuclear speckles: a model for nuclear organelles. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 4: 605–612.

Maeshima K. & Laemmli U. K. (2003) A two-step scaffolding model for mitotic chromosome assembly. Dev. Cell 4: 467–480.

Sims J. K., Houston S. I., Magazinnik T. & Rice J. C. (2006) A trans-tail histone code defined by monomethylated H4 Lys-20 and H3 Lys-9 demarcates distinct regions of silent chromatin. J. Biol. Chem. 281: 12760–12766.

Speicher M. R. & Carter N. P. (2005) The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nature Rev. Genet. 6: 782–792.

Zhimulev I. F. (1998) Morphology and structure of polytene chromosomes. Adv. Genet. 37: 1–566.

Эволюция геномов

Batzer M. A. & Deininger P. L. (2002) ALU repeats and human genomic diversity.

Nature Rev. Genet. 3: 370–379.

Blanchette M., Green E. D., Miller W., & Haussler D. (2004) Reconstructing large regions of an ancestral mammalian genome in silico. Genome Res. 14: 2412–2423.

Cheng Z., Ventura M., She X. et al. (2005) A genome-wide comparison of recent chimpanzee and human segmental duplications. Nature 437: 88–93.

Feuk L., Carson A. R. & Scherer S. (2006) Structural variation in the human genome. Nature Rev. Genet. 7: 85–97.

International Human Genome Sequencing Consortium (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860–921.

International Human Genome Consortium (2004) Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 431: 931–945.

Koszul R., Caburet S., Dujon B. & Fischer G. (2004) Eucaryotic genome evolution through the spontaneous duplication of large chromosomal segments. EMBO J. 23: 234–243.

Margulies E. H., NISC Comparative Sequencing Program & Green ED (2003) Detecting highly conserved regions of the human genome by multispecies sequence comparisons. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 68: 255–263.

Mouse Genome Sequencing Consortium (2002) Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420: 520–562.

Pollard K. S., Salama S. R., Lambert N. et al. (2006) An RNA gene expressed during cortical development evolved rapidly in humans. Nature 443: 167–172.

Sharp A. J., Cheng Z. & Eichler E. E. (2007) Structural variation of the human genome. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 7: 407–442.

Siepel A, Bejerano G, Pedersen J. S. et al. (2005) Evolutionary conserved elements in vertebrate, insect, worm, and yeast genomes. Genome Res 15: 1034–1050.

The International HapMap Consortium (2005) A haplotype map of the human genome. Nature 437: 1299–1320.

The ENCODE Project Consortium (2007) Identification and analysis of functional elements in 1 % of the human genome by the ENCODE pilot project. Nature 447: 799–816.

Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 405

изменению в ДНК. Такое изменение называют мутацией, и оно может привести к гибели организма, если произойдет в жизненно важной позиции последовательности ДНК.

5.1.1.  Частоты мутаций чрезвычайно низки

Частота мутаций — частота, с которой в последовательностях ДНК происходят заметные изменения, — может быть определена непосредственно из экспериментов, проводимых над бактерией вроде Escherichia coli — объект, получивший постоянную прописку в нашем кишечном тракте и часто привлекаемый к лабораторным опытам (о чем было сказано в главе 1). В стенах лабораторий E. coli делится примерно один раз каждые 40 минут, и одна единственная клетка способна породить огромную популяцию — несколько миллиардов — менее чем за день. В такой популяции возможно обнаружить маленькую долю бактерий, которые перенесли повреждающую мутацию в определенном гене — если этот ген не требуется для выживания бактерии. Например, частота мутаций гена, необходимого клеткам для того, чтобы использовать сахар лактозу в качестве источника энергии, может быть определена, когда клетки выращиваются в присутствии иного сахара, например глюкозы. Доля поврежденных генов служит заниженной оценкой действительной частоты мутаций, потому что многие мутации, по природе своей, молчащие (например, те, что изменяют кодон, но при этом не сопровождаются заменой кодируемой им аминокислоты, или же те, что заменяют аминокислоту, но не затрагивают функцию белка, кодируемого поврежденным геном). С поправкой на такие молчащие мутации получается, что индивидуальный ген, который кодирует белок среднего размера (≈ 103 кодирующих пар нуклеотидов), мутирует (не обязательно с инактивацией белкового продукта) примерно один раз в приблизительно 106 поколениях клеток бактерий. Иначе говоря, частота мутаций в бактериях составляет приблизительно 1 нуклеотид на 109 нуклеотидов в одном поколении клеток.

Недавно появилась возможность измерять частоту мутаций непосредственно в зародышевой линии клеток более сложных, воспроизводящихся половым путем организмах, например нематоды C. elegans. Этих червей, у которых время генерации составляет 4 суток, выращивали на протяжении многих поколений, используя свойственный им способ воспроизводства путем самооплодотворения (обсудим в главе 22). Затем определяли последовательности ДНК большой области генома для многих червей-потомков и сравнивали их с соответствующей последовательностью червя-прародителя. Этот анализ показал, что в среднем две новые мутации (главным образом короткие вставки и делеции) возникают в гаплоидном геноме очередного поколения. Если принять во внимание число делений клеток, необходимых для производства сперматозоидов и яйцеклеток, то частота мутаций окажется приближенно равной 1 на 109 нуклеотидов за одно деление клетки — частота, поразительно схожая с таковой для размножающейся бесполым путем E. coli, описанной выше.

Прямое измерение частоты мутаций в зародышевой линии клеток млекопитающих сложнее, но косвенные оценки получить возможно. Один из способов состоит в сравнении аминокислотных последовательностей одного и того же белка у нескольких видов. Долю аминокислот, которые отличаются между любыми двумя видами, можно затем сравнить и соотнести с числом лет, прошедших с момента расхождения этой пары видов от их общего предка, что устанавливается по палеонтологическим данным. Прибегнув к этому методу, можно вычислить число лет,

406 Часть 2. Основные генетические механизмы

которое проходит в среднем, прежде чем наследуемое изменение в аминокислотной последовательности белка становится закрепленным в организме. Поскольку каждое такое изменение обычно отражает изменение одного нуклеотида в последовательности ДНК гена, кодирующего этот белок, то мы можем употребить эту величину для оценки среднего числа лет, необходимого для возникновения единичной устойчивой мутации в соответствующем гене.

Такие вычисления будут почти всегда существенно занижать действительную частоту мутаций, потому что многие мутации будут наносить урон функции белка и исчезать из популяции в силу естественного отбора, то есть в результате преимущественной гибели несущих такие мутации организмов. Но последовательность одного семейства белковых фрагментов, кажется, не имеет особого значения, благодаря чему гены, которые их кодируют, могут накапливать мутации без отбраковки естественным отбором. Это фибринопептиды — фрагменты длиной двадцать аминокислот, которые удаляются из молекулы, когда белок фибриноген активируется и образует фибрин во время свертывания крови. Так как функция фибринопептидов явно не зависит от последовательности аминокислот, они могут безболезненно переносить замены почти любых из имеющихся в их составе аминокислот. Поэтому сравнения последовательностей фибринопептидов могут быть использованы для оценки частоты мутаций в последовательности зародышевых клеток. Как было установлено по результатам этих исследований, типичный белок из 400 аминокислот претерпевает замену аминокислоты примерно один раз каждые 200 000 лет.

Другой способ оценки частоты мутаций у человека состоит в использовании секвенирования ДНК для сравнения соответствующих последовательностей нуклеотидов непосредственно у близкородственных видов в областях генома, которые, по-видимому, не несут жизненно важной информации. Как и следовало ожидать, такие сравнения дают оценки частоты мутаций, которые согласуются с полученными в результате опытов с фибринопептидами.

Бактерии E. coli, черви и человек сильно отличаются друг от друга как способами воспроизводства, так и временем жизни поколений. И все же, когда присущие им частоты мутаций нормируют по единичному циклу репликации ДНК, они оказываются подобными: при каждом событии репликации ДНК изменяется примерно 1 нуклеотид на 109 нуклеотидов.

5.1.2.  Для сохранения жизни в существующей форме частота мутаций должна быть низкой

Так как многие мутации пагубны, ни один вид не может позволить их быстрое накопление в клетках своих зародышей. Хотя наблюдаемая частота мутаций низка, она, как думают, все же ограничена числом жизненно важных белков, которые любой организм может кодировать, то есть примерно 50 000. Развивая этот довод, можно утверждать, что если бы частота мутаций была в десять раз выше, то этим ограничила бы организм до примерно 5 000 генов первой необходимости. В таком случае эволюция была бы тоже ограничена — организмами значительно менее сложными, чем плодовая мушка.

Клетки воспроизводящегося половым путем организма подразделяются на два типа: зародышевые клетки и соматические клетки. Зародышевые клетки передают генетическую информацию от родителя потомству; соматические клетки формируют тело организма (рис. 5.1). Мы убедились, что зародышевые клетки должны