Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии

ГЛАВА Х

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ

Совокупность окислительных реакций, происходящих в биологических

объектах и обеспечивающих их энергией и метаболитами для осуществления

процессов жизнедеятельности, называется биологическим окислением. Функции ЭТого важнейшего биологического явления даже нескольКО шире,

чем это отмечено в приведенном выше определении, так как при посредстве

реакций биологического окисления разрушаются также вредные продукты обмена веществ и проникшие в организм чуждые соединения. Более того,

состояние окислительно-восстановительных процессов в клетках сказывается

на регуляции обмена веществ в них:

!

ЭНВFJгеmU'l8ское

оlеспечсние

туры тела

Разнообразные реакции биологического окисления ускоряются многочис­

ленными ферментами, относящимися к классу оксидоредуктаз. Эти ферменты, Как правило, встроены в биологические мембраны, причем очень часто в виде ансамблей.

ИСТОРИЯ РАЗВ!lТИЯ ПРЕДСТАВЛЕНИй О МЕХАНИЗМАХ РЕАIЩии БИОЛОГИЧЕСКОГО ОКИСЛЕНИЯ

Разобраться в столь сложном явлении, как биологическое окисление, воз­

можно лишь после ознакомления с теми концепциями, которые постепенно

складывались по мере исследования этой проблемы.

Хотя более двухсот лет тому назад (1774-1777) А. Лавуазье считал

дыхание очень медленным горением продуктов питания в организме,

сходным со сгоранием угля, первая попытка выявить молекулярный механизм

411

биологического окисления была предпринята лишь в следующем стодетии Хр. Ф. Шёнбайном (1845-1868). Им была выдвинута идея о том, что необ­

ходимым условием протекания биологических окислительных процессов явля­ ется активирование кислорода. Естественно, что конкретные пути этого

активирования выглядели фантастически (предполагалось существование от­ рицательно-активной формы кислорода, тождественной озону и положитель­

но-активной, названной антиозоном), но сама идея была плодотворна.

Хр. Ф. Шёнбайн впервые высказал мысль о том, что биологическое окисление есть каталитический процесс. Ему же удалось экспериментально доказать образование Н2О2 при биологическом окислении.

На рубеже XIX и хх вв. наш соотечественник А. Н. Бах и независимо от него в Германии К. Энглер и В. Вилд выдвинули гипотезу об образовании

пероксидов органических соединений как первом этапе биологического окисле­

ния. При этом молекула кислорода переводилась в активированное состояние

за счет разрыва двойной связи в ней при посредстве «внутренней колебатель­ ной энергии» самого окисляемого соединения, обладающего кратной связью,

и при участии ферментов-оксидаз в соответствии с такой, например, схемой:

Возникшие пероксиды органических соединений, как и пероксид водорода,

могут окислять друтие вещества при каталитическом воздействии пероксида­

зы-фермента, достаточно в то время уже изученного:

Пероксид водорода может распадаться и иным путем, при участии фермен­

та каталазы, о котором в этот период тоже накопилось довольно много

сведений:

Вероятно поэтому, А. Н. Бах придавал большое значение участию в биоло­

гическом окислении пероксидазы и каталазы, полагая, что распределение

Н2О2 между пероксидазой и каталазой может служить для регуляции этого

процесса, например, в растениях.

В последующее время названным ферментам в окислительно-восстанови­ тельных процессах отводили более скромную роль.

Однако в свете данных об активных состояниях кислорода, о существова­ нии супероксид-ионов и ферментов, принимающих участие в их обмене,­ супероксиддисмутаз. значение, придаваемое Н2О2, каталазе и пероксидазе

в реакциях биологического окисления, стало неуклонно возрастать.

Принципиально иной подход к расшифровке механизмов реакции биологи­ ческого окисления был намечен в трудах В. И. Палладина, а вслед за ним­ Г. Виланда. На основаниц: опытов с дыхательными хромогенами (под ними он ') подразумевал бесцветные вещества растительного происхождения, спосоБН~Iе_

412

-в присутствии оксидаз присоединять кислород и переходить при этом в пиг­

менты, которые, в свою очередь, могли передавать присоединенный кислород

окисляемому субстрату, одновременно обесцвечиваясь), В. И. Палладин впер­

вые (1912) высказал идею о том, что биологическое окисление есть переное водорода от окисляемого вещества навстречу кислороду с образованием воды

в качестве конечного продукта. К этой идее В. И. Палладин пришел после

того, как в одном из опытов обнаружил, что метиленовый синий, не содержа­ щий в своем составе кислорода, может играть роль дыхательного хромогена,

снимая атомы водорода с окисляемог<? субстрата:

Стало ясно, что дыхательные хромогены являются не переносчиками кислоро­

да, а акцепторами водорода.

Концепция В. И. Палладина довольно быстро получила подтверждение.

Благодаря трудам Т. Тунберга, Д. Самнера, Г. Сомерса, В. Мак-Шена и дру­ гих были выделены и охарактеризованы разнообразные дегидрогеназы, уско­ ряющие реакции окисления тех или иных субстратов при участии кофермен­

тов, являющихся акцепторами снимаемых с IШX атомов водорода.

Таким образом, в начале нашего столетия сложились две концепции биоло­

гического окисления: активирования кислорода и активирования водорода. их

противоборство продолжалось недолго: в 1925 г. Д. Кейлип в тканях ряда

насекомых, а затем и в других аэробных биолоmческих объектах открыл

цитохромы-те недостающие ферменты, которые позволили несколькими

годами позже связать активирование кислорода и водорода воедино. Этому

способствовало обнаружение О. Варбургом (1928) цитохромоксидазы, получи­

вшей в то время наименование «дыхательного фермента Варбурга», Именно

цитохромоксидаза оказалась тем ферментом, который непосредственно ак­

тивирует кислород, а цитохромы-ферментами, снимающими электроны

с водорода и передающими их цитохромоксидазе. Так впервые возникло

представление об ансамблях ферментов дыхательной цепв, обеспечивающих реакции биологического окисления. В частности, оксидоредуктазная цепь,

главной составной частью которой являются цитохромы, получила название

цитохромной системы:

СУбстратх Деrидроrеназа ЦИТОХРОМЫХ ЦИТОХРОМОlCсидаза

(2Н) (2ё)

Ферменты, находящиеся в конце таких оксидоредуктазных цепей и непо­

средственно переносящие электроны на кислород, получили название терми­ нальных оксидаз.

413

Позже (1947-1966) было показано, что цитохромной сuстемой не исчер­

пывается перечень ферментных систем, способных активировать и водород,

и :кислород с последующим образованием из них моле:кул воды. Та:ких систем

несколько. Простейшая из них иаряду с пероксидазными реющиями-I'JIИКО­

nатоксидазваи:

Она представлена в растениях, у животных, rрибов и бактерий. Гли:колаток­

сидаза из листьев шпината-флавопротеин с М = 270 000 (8 х 37000). Четвер­

тичная структура октамера гликолатоксидазы и третичная структура субъеди­ ниц недавно выяснена; имея около 10 им в диаметре, октамер, составленный

из 4 димеров, обладает полостью диаметром 6 нм. Гликолатоксидаза содер­

жит флавинмононуклеотид (см. с. 120) в :качестве :кофермента; при его посред­ стве деmдрируется гликолевая кислота (активирование водорода). Вместе

с тем гликолатоксидаза способна активировать кислород и передавать на него

атомы водорода с восстановленного флавинмононуклеотида с образованием

Н2О2• т. е. ей присуща флавопротеино:ксидазная функция. Образовавшийся

перо:ксид водорода распадается при участии каталазы.

В настоящее время изучено более двух десятков оксидаз флавопротеиновой

природы. содержащих ФМН и ФАД в качестве коферментов (оксалатоксидаза. глюкозооксидаза, оксидазы L-аминокислот. ксантиноксидаза и др.).

Другой тип ферментных систем, обеспечивающих вепосредствеввое окиcnе­ иве субстратов с передачей атомов водорода на кислород, представлен медьсо­

держащими оксидазам•. Так как концентрированные растворы этих ферментов имеют синий цвет, их называют «синими оксидазами». Характерным предста­ вителем этой групПld о:ксидаз является аскорбатоксидаза-белок

с М=130000-140000, содержащий 8 атомов cu на молекулу и состоящий из

двух равных субъединиц. Она открыта А. Сцент-Дьердьи (1928) и очищена Х. Таубером (1938). Уравнение реакции ОJ<исления аскорбиновой кислоты при­ ведено на с. 171.

Развитие представлений об оксидоредуктазных системах, участвующих 8 осуществлении биологического окисления, сопровождалось уточнением их

функций, классификации и номенклатуры входящих в их состав ферментов. Напомним (СМ. с. 117), что те деГИдрогеназы, которые обеспечивают непо­

средственное деrидрирование субстратов, назьпзаются первичными. В отличие

от них дегидрогеназы, получающие атомы Н от восстановленных кофермен­

тов первичных дегидрогеназ (НАДН, НАДФН, ФМН· Н2, ФАД· Н2 и др.)'или от промежуточных акцепторов, на которые были переданы атомы водорода

спервичных дегидрогеназ, отнесены к категории вторичных дегидрогеназ.

Любые дегидрогеназы (и первичные, и вторичные), передающие атомы водо­ рода на определенные акцепторы. назьшают редуктазами. Как отмечено ранее,

все оксидоредуктазы, переносящие атомы водорода или электроны непосред­

ственно на кислород, называют оксидазами.

В связи с этим было обращено ВlЩмание на окислительно-восстановитель­

ные системы, в которых между дегидрогеназами и молекулярным кислородом

действует посредник. Атомы Н с восстановленной дегидрогеназы сначала

поступают на OJшсленную молекулу посредника, а потом уже с нее-на 02.

Обе реакции ускоряют специфическими ферментами. Конечным ПРОДУI(ТОМ

414

реакции является вода. Наиболее часто роль посредников играют хвноны

и ас:к()рбииовая кислота. При этом во взаимодействии с посредником учаСТ8ует

только восстановленный кофермент, например НАДН или НАДФН.

В случае фенолхиноновой системы схема процесса такова:

ХинонреДУКТ838 r...-F\....

НАДН+Н+ ~ ~_о

Первые данные о существовании совершенно нового путн биологического

окисления, не похожего на Все изученные ранее, были сообщены Е. Андре и К. Хоу (1932), открывшими в семенах сои особый фермент-липоксидазу.

ОН УСКОРЯЛ реакцию прямого присоедииения атмосферного кислорода по двой­

ным связим полиненасыщенных высших жирных кислот. Применение 1802 и Н218О дЛЯ экспериментального изучения аналогичных реакций позволило

в 1955 г. одновременно инезависимо Г. Мэзону с сотр. И О. Хайаиши с сотр.

доказать наличие нового подкласса оксидоредуктаз-оксигеназ и изучить механизмы включения молекулярного кислорода при их посредстве в различ­

ные органические молекулы.

Согласно срвременным данным, липоксигеназа имеет молекулярную массу от 60000 до t 00000 в зависимости от объекта выделения, распространена не

только в растительном, но и в животном мире, существует в виде ряда

молекулярных форм. В случае линолевой кислоты реакция идет в соответст­

вИв с УРSDllением:

сНз-(СН2)4-С Н-СН-СН2-СН=СН-(С Н2)'-СООН Линолевая кислота

r 02

ЛИПоКtигена3а

J

СНЗ-(СН2)4--СН-СН=СН -СН=СН-(СН2),-СООН

~OH

13-Гядроперокси- цис-9-транс-ll-йктадеICадиенооая

RИСЛОта

Липоксигеназы принимают участие в биосинтезе простагландинов, лейко­

триенов и тромбоксанов из арахиДОНОВОЙ кислоты (см. с. 463). .

Новую главу в учении о биологическом окислении составило открытие В. А. Энгельгардтом (1931) сопряжения реакций окисления органических со­ единений с фосфорилированием АДФ. Определяя содержание аденазинпиро­

фосфорной кислоты, условно названной им пирофосфатом, в энергично дыша­ щих эритроцитах голубя, он установил, что в атмосфере азота оно падает, а в атмосфере кислорода - возрастает до исходной величины. Повторение период~ анаэробиоза с 1юзвращением к аэробиозу сопрово~далось новым

415

циклом «распад-ресинтез» пирофосфата. Это означало, что существует ~a­

кой-то механизм, при помощи которого энергия, выделяющаяся при окисле­

нии (в присутствии кислорода), не рассенвается, а используется для связыва­

ния, деминерализации неорганического фосфата, который обнаруживается

в макроэргнческнх связях аденозннтрнфосфата: АДФ+НзРО4-АТФ+Н2О.

Позже идеи В. А. Энгельгардта БЬ1ЛИ более детально разработаны

В. А. Белицером с сотр., внесшими существенный вклад в развитие проблемы

сопряжения окисления с фосфорилировщшем в период ее становления. В част­ ности, В. А. Белицером было введено понятие: коэФФициент окислительного фосфорилирования, т. е. отношение количества молей синтезированной АТФ

к количеству молей кислорода, использование которого обеспечивало этот

синтез. Будучи вычислено после ряда измерений, значение коэффициента

оказалось в среднем близким к 3,0, что свидетельствовало о том, что перенос двух атомов водорода (а в дальнейшем-двух электронов) по дыхательной

цепи ферментов сопровождается синтезом трех молекул АТФ, т. е. существует

три пункта сопряжения окисления с фосфорилированием АДФ.

Исследование тонких механизмов сопряжения окисления с фосфорилировани­

ем, являющееся фундаментом биоэнергетики, продолжается уже более полусто­ летия и еще далеко от завершения. Ниже будет освещено его ньmешнее состояние,

отражающее всю сложность современных проблем биологического окисления.

КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОКИСЛЕНИЯ

И ИХ ЛОКАЛИЗАЦИЯ В КЛЕТКЕ

Приведенный выше краткий исторический очерк содержит достаточно

конкретного материала для того, чтобы стало понятным существование двух

типов биологического окисления.

1. Свободное окисление, не сопряженное с фосфорилированием АДФ, не

сопровождающееся трансформацией энергии, выделяющейся при окислении,

в энергию макроэргических связей. При свободном окислении высвобожда­ ющаяся при сопряженном с окислением распаде химических связей энергия

переходит в тепловую и рассеивается.

По типу свободного окисления идут все без исключения оксигеназные

реакции, все окислительные реакции, ускоряемые пероксидазами или сопровож­

дающиеся образованием Н2О2, многие реакцИи, катализируемые оicсидазами.

Процессы свободного окисления сосредоточены в цитозоле, в мембранах эндоплазматической сети клетки, в мембранах лизосом, пероксисом и ап­

парата Гольджи, на внешних мембранах митохондрий и хлоропластов. Они

идут также в ядерном аппарате клетки.

2. Окнсление, сопряженное с фосфорнлированием АДФ. Этот тип биологиче­

ского окисления осуществляется двумя способами.

Если макроэргическая связь возникает в момент непосредственного окис­ ления ~убстрата, а затем тем или иным путем передается на фосфатный

остаток, который, в свою очередь, используется для фосфорилирования АДФ,

т. е. синтеза АТФ, то такой вид биологического окисления называют окисле­ нием, сопряженным с фосфорилированием АДФ на уровне субстрата. Ранее такой способ называли фосфорилирующим окислением или субстратным фос­

форнлированием.

Если атомы водорода с коферментов дегидрогеназ, принимающих участие

в окислении субстратов, передаются в оксидоредуктазную цепь, где сопряжен­

но с переносом протонов и электронов на молекулярный кислород происходит

416

активирование неорганического фосфата и при его посредстве фосфорилирова­ ние АДФ с образованием АТФ, то такое сопряжение окисления с синтезом

АТФ называют сопряжением на уровне электронотранспортвой цепи. Понятно,

что сам окисляемый субстрат в этом случае непосредственного участия в ак­ тивировании неорганического фосфата не принимает. Ранее этот вид биологи­ ческого окисления называли окислительным фосфорилированием и отождеств­

ляли с дыханием.

Сопряжение окисления с фосфорилированием, т. е. генерирование АТФ дЛЯ

нужд клеток, идет главным образом на внутренних мембранах митохондрИЙ.

Именно здесь осуществляется сопряжение окисления с фосфорилированием на

уровне электронотранспортной цепи. Что касается субстратного фосфорили­ рования:, то оно сосредоточено в растворимой части клетки.

Фотосинтетическое и хемосинтетическое фосфорилирование АДФ, сопро­

вождающееся биосинтезом АТФ, также происходит путем сопряжения перено­

са электронов в электронотранспортных цепях с активированием неорганиче­

ского фосфата. Механизм этого сопряжения близок к таковому при окис­

лительном фосфорилировании в митохондрш, что подчеркивает единую

природу процессов, приводящих к синтезу АТФ у гетеротрофных и аутотроф­

ных организмов.

СВОБQЦНОЕОКИСЛЕНИЕ

Реакции свободного окисления органических соединений в живой природе,

. равно как и ферментные системы, ускоряющие их, многообразны, и многие из

них рассмотрены в предыдущих главах и в начальном разделе этой главы.

Этим путем непосредственно окисляются не только многочисленные природ­

ные и неприродные субстраты, но и восстановленные коферменты (НАДН, НАДФН, ФАД . Н2 и др.), образовавшиеся при действии первичных и вторич­

ных дегидрогеназ.

Хотя реакции свободного окисления идут и в цитозоле, и на мембранах различных субклеточных структур, средоточием их являются мембраны эн­

Доплазматической сети клетки. Так как последние при гомогенизации клеток

и фракционировании субклеточных частиц гомогената дают фракцию микро­

сом, которая может быть получена в виде препарата, то сейчас активно изучаются организация и функции микросомальной дыхательной цепи. Ее

первая особенность сводится к тому, что, несмотря на наличие ферментов цепи

переноса электронов, ни в одном пункте этой цепи не происходит сопряжения

с фосфорилированием АДФ. Вторая особенность заключается в своеобразии структуры и функциональной активности цитохромов Ь s и Р-450), входящих

в ее состав. В частности, цитохром Р-450 (М:::::: 50 000, гемопротеин, первичная:

структура более десятка его форм расшифрована) обладает множеством (сот­ ни, а может быть, и тысячи) форм, возникающих в ответ на введение (или попадание) в организм того или иного класса ксенобиотиков, подобно тому,

как антитела синтезируются в ответ на присутствие антигенов; поэтому

цитохром Р-450 считают своего рода «мембранным иммуноглобулином». Наконец, третья особенность состоит в высоком сродстве терминальной

оксидазы микросомальных цепей к :кислороду, позволяющая ей конкурировать за кислород с митохондриальной цитохромоксидазоЙ. Поэтому, например, в клетках печени доля микросомального окисления эндогенных субстратов

составляет 40%, а митохондриального-60%.

Наиболее своеобразными и почти не затронутыми в предыдущих главах

являются реакции свободного окисления, идущие при участии оксигеназ. Этот

подкласс оксидоредуктаз содержит ферменты, ускоряющие включение в окис·

ляемый субстрат либо двух (диоксигеназы), либо одного (монооксигеназы)

атома молекулярного кислорода.

Свободное окисление при участии диоксиrеназ. Одной из наиболее изученных диоксигеназ является пирокатехаза (катехол: кислород·},2-0ксидоредуктаза дециклизующая); ее М =85 000. Концентрированные растворы пирокатехазы

красного цвета, так как она содержит в активном центре два прочно связанных

атома Ре, которые, согласно о. Хайаиши, соеДИlIЯЮТСЯ с молекулярным кис­

лородом в комплекс, где кислород далее активируется: Fe2 ++02 _Fe2 +02 _

_ FеЗ+Оi·

Затем в активном центре пирокатехазы после присоединения субстрата

возникает тройной комплекс, преобразование которого приводит К включе­

нию молекулярного кислорода в пирокатехин:

Аналогично действует 'катехол-2,3-0I\сйгеназа (М= 140000, 1 атом Ре), 3,4-диоксигеназа протокатеховой кислоты (М = 700 000, 8 х 90000), образую­ ЩaJ{ Р·карбоксимуконовую кислоту, триптофаноксигеназа (м = 123000), при­

соединяющая молекулярный кислород по пиррольному кольцу индолильного

радикала, и другие диоксигеназы. Во всех случаях молекулярный кислород

активируется за счет присоединения электрона, теряемого двухвалентным

железом активного центра, а возникший анионный свободный радикал кисло­

рода (O~-) атакует и оксигенирует субстрат. В результате расшифровки

механизма действия диоксигеназ стал ясен один из способов активирования

молекулярного кислорода терминальными оксидазами.

Одной из биологически важных диоксигеназных реакций яВляется превра­

щение Р-каротина в витамин А:

02j/J-Карот"и-15.IS'-оКtиrеJ!103I

"(содер.иtF.2+, активирующий 02)/l-Каротии

~O

РетиtillЛЬ (витамин А)

Прямое присоединеnие 1802 по 15,15'-связи В Р-каротиие впервые доказано

Б. Б. Вартапетяном и сотр. (1966).

Свободное окисление при участии монооксиrеиаз. Ввиду высокой лабиль­

ности монооксигеназ, как, впрочем, и диоксигеназ, выделение их сопряжено

с большими трудностями. Тем не менее некоторые из них получены 11 кристал-

418

лическом СОстоянии. Монооксигеназы характеризуются молекулярными мас­

сами от 65000 до 200000, отсутствием, как прав!t.JТO, в их составе ионов

тяжелых металлов и наличием коферментов флавиновой природы. Кроме того, многие из них требуют участия в реакции монооксигенирования так

называемого парного донора, от которого поступают атомы водорода на один

из атомов молекулярного кислорода (второй внедряется в окисляемый суб­ страт).

Простейший представитель монооксшеназ-фенолгидрокси.лаза (фенол-2-

монооксигеназа):

Монооксигеназы принимают большое участие в окислении аминокислот (лизин-, аргинин- и триптофанмонооксигеназы, фенилаланин- и тирозингид­

роксилаза), ОКСlIКислот (салицилатгидроксилаза), полиизопреиоидных соеди­ нений (сквален-эпоксидаза, см. с. 404).

Механизм действия монооксигеназ выяснен недостаточно. Предполагают,

что активной формой кислорода может быть связанный с ферментом перок­

сид водорода или его эквивалент. fv1;ежду тем показано, что некоторые из

монооксигеназ (фенолаза из грибов, фениланин-4-гидроксилаза) содержат еи+

в своем составе. В этих случаях возможен такой механизм активирования

кислорода:

Здесь, как и в случае диоксигеназ, решающую роль в активировании

молекулярного кислорода играет передача на него электронов с металла,

входящего в состав фермента. Не исключено, что этот способ вовлечения

молекулярного кислорода в процессы оксидоредукции в клетке является об­ Щlf:м д.!IЯ оксидаз, участвующих как в свободном, так и в сопряженном

с фосфорилированием биологическом окислении.

ОКИСЛЕНИЕ, сопряжЕННОЕ С ФОСФОРИЛИРОВАНИЕМ АДФ

Субстратное фосфорилирование. Примерами сопряжения окисления с фос­ форилированием на уровне субстрата могут служить реакции окисления 3- фосфоглицеринового альдегида в 1,3-дифосфоглицериновую кислоту, 2-фос­ фоглицериновой кислоты-в 2-фосфоенолпировиноградную, а.-кетоглутаро­

вой кислоты-в янтарную кислоту (здесь фосфорилируется ГДФ-см.

рис. 117). С возникающих при этом соединений фосфат, связанный макроэр­

гической связью, легко передается на АДФ (или ГДФ). ОДИН из примеров

419