Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии

двухвалентных катионов, особенно Mg2+, обладает высокой молекулярной

массой (240 000; тетрамер) и образует прочный комплекс с другими фермента­

ми, участвующими в карбоксилировании рибулозо-l,S-дифосфата.

Механизм реакции карбоксилирования рибулозо-l,S-дифосфата достаточ­

но ясен. Спачала это соединение. преобразуется в епольную форму:

Она присоединяет СО2, и возникший промежуточный продукт расщепляет­ ся на две молекулы фосфоглицериповой :кислоты:

Приведенпые выше уравнения представляют, конечно, лишь грубую схему

тех тонких процессов, которые происходят во время карбоксилирования рибу­ лозо-l,S-дифосфата в активном центре специфического фермента, ускоряюще­ то многостадийные преобразования при акцептировании СО2. Этот самый распространенный на Земле фермент называют рибулозодифосфаткарбоксила­ зой (РДФК). Ero систематическое пазвание-З-фосфо-D-глицерат карбокси­

лиаза димеризующая. К настоящему времени он выделен из нескольких

десятков объектов (высшие растения, зеленые водоросли, сине-зеленые водо­ росли, фототрофные и хемоавтотрофные бактерии). При молекулярной массе в SOO 000-600 000 он обладает четвертичной структурой (8 больших субъеди­

ниц с M=SOOOO-БОООО и 8 малых с М=12000-15000), которая изучена

методами pemreHocтpyктypHoro анализа и электронной микроскопии

(рис. 119). Большие субъединицы являются каталитическими и несут центры

связывания рибулозо-l,S-дифосфата и СО2, а малые-регулято~ и име­

ют ряд аллостерических центров ДЛЯ соединения с эффекторами (Mg2+, фрук­

тозо-б-фосфат, НS-содержащие соединения и др.). Субъединицы РДФК син-

360

•

••" r..• •

~,~

Рис. 119. Структура ри6улозодифосфаткар60КСИЛазы:

"етвертичная-высших растений (а) н водородных бажтерий (б-вид сбоку, е-вид сверху), изучeивu ЭJIеКТРОННО-М1II<РОСkОПИЧескн; третичная-малоli субъединнцы высших растений. юучеИИaR методом рент­ reHOCTpYXТYPHoro аналнза (2). Остальные ПОRсненИJI-В таете

хронно синтезируются: большие-на рибосомах 70S в хлоропластах, ма­ лые-на рибосомах 80S в цитоплазме, спонтанно собираясь в нативный

мультимер.

В значительной мере выяснены структура и работа активного центра

РДФК; предполагают, что рибулозо-l,S-дифосфат связывается в нем за счет

взаимодействия фосфатных групп с радикалами лизина, енолизация суб­

страта идет при участии НS-групп (их насчитывается 96), акцептирование

СО2 по енодиольной группе сопровождается переносом протонов при помо­

щи гистидиновых остатков. РДФК активируется светом при помощи свето­ чувствительного белкового фактора (М = 4000-8000) и ингибируется моле­ кулярным кислородом, инициирующим оксщеназную (см. гл. Х) функцию (т. е. окисление рибулозо-l,S-дифосфата в 3-фосфоглицериновую кислоту и 2-фосфогликолевую кислоту) этого уникального фермента, обеспечива­ ющего фиксацию СО2 и первичный биосинтез углеводов в космических

масштабах.

Как отмечено выше, центральную роль в осуществлении фотосинтеза играет трансформация энергии света в разность потенциалов мембраны

фотосинтетического центра и сопряженный с этим синтез АТФ. Недавно,

используя методы спектроскопии, рентгеноструктурного анализа и молеку­

лярной генетики, удалось получить детальную картину событий, проис­

ходящих при фотосинтезе и выявить пространственное расположение

и роль белков и пигментов, участвующих в этом процессе. За эту работу

немецкие ученые Р. Хубер, И. Дайзенхофер и Х. Михель удостоены Нобе­

левской премии 1988 г.

Возникшая в результате рассмотренных выше процессов фосфоглицерино­

вая кислота восстанавливается в 3-фосфоглицериновый альдегид:

З-Фоrфоr",ицернно,

.ый .....At'rHA

Данная реакция тоже идет более сложным путем, нежели показано в при­

веденном выше уравнении. Она представляет собой обращение процесса пе­

рехода 3-фосфоглицеринового альдегида в 3-фосфоглицериновую кислоту,

361

r

осуществляющееся при дихотомическом распаде глюкозы. Напомним, что

указанный процесс ускоряется глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и идет

через 1,3-дифосфоглицериновую кислоту с тем лишь отличием, что содержа­ щаяся в хлоропластах форма этого фермента специфична в большей степени

к НАДФН, чем к НАДН, отличается очень высокой молекулярной массой

(БОО000) и специально приспособлена для восстановления фосфоглицериновой

кислоты в фосфоглицериновый альдегид. Это значит, что при восстановлении 3-фосфоглицериновой кислоты в 3-фосфоглицериновый альдегид будет рас­

ходоваться АТФ (см. уравнение реакции на схеме 5, с. 344).

Следовательно, на этой стадии биосинтеза углеводов снова исполь­ зуется АТФ, образовавшаяся при фотосинтетическом или хемосинтетиче­

ском фосфорилировании и энергетически обеспечивающая новообразова­

ние углеводов. Здесь же, как следует из приведенного выше уравнения

реакции восстановления 3-фосфоглицериновой кислоты, осуществляется

в сущности восстановление акцептированного СО2 при посредстве

НАДФН, возникшего одновременно с АТФ на первой фазе фотосинтетиче­

ского процесса.

Дальнейший путь синтеза углеводов из 3-фосфоглицеринового альдегида, так же как и только что рассмотренная реакция восстановления 3-фосфо­

глицериновой кислоты, представляет обращение дихотомического пути распада

углеводов: фосфоглицериновый альдегид переходит в фосфодиоксиацетон; при каталитическом воздействии альдолазы из упомянутых фосфотриоз синтези­ руется фруктозо-l,б·'дифосфат, переходящий далее в глюкозо-б-фосфат. На этом этапе биосинтеза углеводов действует особый фермент-фруктозо-l,6- дифосфатаза (молекулярная масса фермента из растений и фото- и хемосин­

тезирующих организмов-130000-190000; две субъединицы; отличается аб­

солютной специфичностью), обеспечивающая переход от фруктозо-I,6-дифос­ фата к фруктозо-б-фосфату, так как реакция:

фРУКТОЗО-б-фосфат+АТФ = фруктозо-l,б-дифосфат+АДФ

практически необратиМа. Фруктозо-б-фосфат, как известно, легко превращает­

ся в фосфорные эфиры других моносахаридов, что в итоге обеспечивает синтез всего набора природных моноз, а из них-дисахаридов и полисахаридов. Ход

реакции первичного новообразования углеводов в процессе фотосинтеза дан

на схеме 9.

Что касается синтеза простых углеводов организмами-гетеротрофами, то

исходными веществами для этого могут служить продукты распада липидов,

белков и других органических соединений. Центральным звеном в переходе этих соединений в простые (а далее и сложные) углеводы является образование

-пвк, возникающей или непосредственно (например, при распаде аминокис­

лот), или при посредстве глиоксилового цикла-при декарбоксилировании

шавелевоуксусной кислоты (см. с. 395). Переход от пвк к углеводам осущест­

вляется путем обращения процесса дихотомического распада углеводов, сле­

довательно, из каждых двух молекул ывк образуется одна молекула Фрукто­

зо-l,б-дифосфата. Однако здесь ~TЬ одна особенность: переход от пвк к фос­

фоенолпировиноградной кислоте идет обходным путем через

щавелевоуксусную кислоту вследствие необратимости реакций превращения

фосфоенолпирувата в пвк. Так эта реакция протекает в печени, почках и других тканях животных, в листьях и корнях растений и у микроорганизмов.

Только в мышцах действие пируваткиназы обратимо, и фосфоенолпировиног­ радная кислота возникает из ПВК и АТФ.

Кроме рибулозо-I,5-дифосфатного пути, существует еще два механизма акцептирования СО2, занимающих подчиненное положение по отношению

к первому.

362

+

ТАnьдоnаза

Фруктозо -1.6- дифосфат

~

Углеводы

Схема 9. Механизм биосинтеза yrлево~ов в растениях

Один ИЗ них состоит в карбоксllЛИJЮВании фосфоеВОЛПllpОВВRоградвоl

ЮlСЛОТЫ:

Фермент, ускоряющий эту реакцию, выделен из растений (обладающих

C4-ТИnОМ фотосинтеза), хемосинтезирующих и гетеротрофных бактерий (М ~

400000; четыре субъединицы).

363

Другой механизм акцептирования СО2 сводится к карбоксилирова"ию аци­

Jlьных производных коэнзима А (ацетил-КоА, пропионил КоА, сукцинил-КоА).

Например:

Пнруватсивтаза

СНз -со-КоА+СО2 +Ферредоксин (восст.)-----

-СНз-СО-СООН+НSКоА+ФерреДоксин (окисл.)

Донорами атомов Н в указанных реакциях служат ферредоксины-желе­ зосодержащие белки негеминовой природы с М ~6000 У бактерий и около 17000 в хлоропластах. Они содержат несколько атомов Fe, собранных в кла­

стер и присоединенных, с одной стороны, к радикалам цистеина белковой части, а с другой-связанных с атомами лабильной серы.

Продукты, возникающие по фосфоенолпируват- и ацилкоэнзим-А-кар­ боксилазному механизму (пировиноградная, сх-кетоглутаровая и щавелевоук­

сусная кислоты), используются для биосинтеза структурных элементов бел­

ков, углеводов, нуклеиновых кислот и липидов или обмениваются далее

в цикле трикарбоновых и дикарбоновых кислот, усиливая, таким образом, метаболические возможности организма. Это послужило основанием для

создания препарата-карбостимулина (NаНСОз-25 г, MgS04 · 7Н2О-З г, MnS04 ·7Н2О-О,05 г, ZnS04 ·7Н2О-О,05 г, цитрат натрия-7 г), находя­

щего благодаря работам школы акад: М. Ф. Гулого все более широкое

применение для повышения продуктивности животных, в медицинской прак­

тике и т. п.

Синтез олигосахаридов. Долгое время предпринимались безуспеш­

ные попытки доказать, что синтез олигосахаридов, в частности дисахари­

дов, представляет собой реакцию обращения их гидролиза. Однако, несмот­

ря на многочисленные эксперименты такого рода, никто не сумел подоб­

рать условия, при которых удалось бы направить вспять реакцию гид­

ролиза, например сахарозы, протекающую при участии р-фруктофуранози­

дазы (сахараза).

Оказалось, что биосинтез олигосахаридов осуществляется путем реакций

транСГJlllКознлированвя. Перенос гликозильного остатка на один моносахарид

идет с фосфорного эфира другого моносахарида и ускоряется специфической

ГJlllКозилтрансферазоЙ.

Исходными соединениями, с которых в процессе синтеза олигосахаридов

гликозильный остаток энергично переносится на моносахарнд, служат нукле­

озвддифосфатсахара (НДФ-сахара).

Они были открыты л. Лелуаром с сотр. (1950) и очень быстро привле­ кли к себе внимание как наиболее вероятные метаболиты в биосинтезе

углеводов. В настоящее время известно свыше 50 представителей НДФ-

Ясна и причина их особого значения в качестве доноров гликозильных остатков: при гидролизе НДФ-сахаров изменение уровня свободной энергии

значительно выше, чем, при гидролизе других доноров, а нуклеоmдная часть

их молекул способна обеспечить избирательность гликозилтрансферазной ре­

акции.

В случае синтеза сахарозы,-например, специфический фермент-сахарозо­

сннтаза, ускоряет реакцию переноса остатка глюкозы с уридиндифосфат­

глюкозы на фруктозу (см. с. 365).

Долгое время считали, что именно так синтезируется сахароза в растениях (животные не синтезируют сахарозу, а лишь используют ее). Однако оказа-

364

Н 9Н ОН

,...., O-P-o-~-o-

НОН g 8

+

ОН ОН

УридиидИфосфатглюкоэа р-D-Фруктоэа

(УДФ-глюкоэа)

лось, что эта реакция ввиду ее обратимости служит дли поддержании равнове­ СИИ между сахарозой н УДФ-rлюкозой и даже используется для наработки УДФ-глюкозы во время ее энергичного использования для биосинтеза крах­

мала и гликогена (см. следующий раздел этой главы). Этот процесс, в част­ ности, идет в больших масштабах в клубнях растений, запасающих крахмал.

Сахароза же в действительности синтезируется при помощи гликозилтранс­

феразной реакции из УДФ-глюкозы и фруктозо-6-фосфата:

УДФ-глЮКОJо+ФрукmОJо-6.Р СахаРОЗОфOCфiIm-сuнmо3f1.

(уДf/J-глюкоза: D-фрукmозо­

б-ФОСфат -2-а,-глюкозuл­ mраНСФ6Рt13l1)

--....УДГР + CaxaPDJo-6-f/Jосфат

~фаmll3а

Сахароза н3 РОf

Как видно из уравнения реакции, сахарозофосфат-синтаза (молекулярная

масса фермента из проростков пшеницы-380000) действует в паре с фосфа­

тазой, которая обеспечивает молниеносное отщепление остатка фосфорной

кислоты от сахарозо-6-фосфата, чем полностью сдвигает реакцию вправо.

Этот процесс идет в листьях растений, и образовавшаяся сахароза, оттекает из них в клубни и корни. Аналоmчно синтезируется глайный дисахарид насеко­

мых, высших и низших грибов и микобактериЙ-трегалоза.

Будучи широко распространены в природе, НДФ-сахара синтезируются из фосфорных эфиров моносахаридов и соответствующих нуклеозидтрифосфа­

т,ов путем нуклеотидилтрансферазных реакций, например:

365

Известно более двух десятков нуклеотидилтрансфераз, ускоряющих реак­

цию переноса тех или иных нуклеотидных остатков на соответствующие

фосфорные эфиры моносахаридов с освобождением пирофосфата. Наряду

с фосфорными эфирами моносахаридов и нуклеозиддифосфатсахарами роль доноров гликозильных остатков в реакциях биосинтеза олигосахаридов MorYT

выполнять сами олигосахариды, а также декстрины.

Из сказанного выше ясно, что биосинтез олигосахаридов идет путем переноса гликозильных остатков на моносахариды с разнообразных субстра­

тов при участии в каждом конкретом случае соответствующих гликозилтранс­

фераз. При этом новообразование химических связей сопряжено с распадом

их в тех соединениях, с которых идет перенос гликозильных остатков.

С и нт е з п о л и с ахариД о в. Подоб}JО синтезу олигосахаридов новообра­

зование полисахаридов также идет путем транСГJIIIКозилирования. Полная ана­ логия существует и в характере субстратов, с которых переносятся гликозиль­

ные остатки на конец растущей цепи полисахарида. Ими MorYT быть фосфор­

ные эфиры моноз, НДФ-сахара и олигосахариды. Реакции переноса остатков

моносахаридов в процессе биосинтеза полисахаридов ускоряются соответству­

ющими гликозилтрансферазами. Приведем несколько примеров.

Синтез амилозы, целлюлозы и подобных им 1,4-гmoканов может проис­

ходить путем переноса гликозильных остатков с гmoкозо-l-фосфата или ана­

логичных фосфорных эфиров моносахаридов. Эта реакция представляет собой

обращение реакции фосфоролиза указанных соединений (см. с. 333). Однако

более существенное значение IJMeeT другой путь: биосинтез из НДФ-сахаров при участии соответствующих трансгликозндаз. Это уравнение реакции нара­

щивания молекулы а.-l,4-глюкана на один остаток глюкозы представлено на

с. 367.

Как следует из приведенного уравнения реакции, перенос гликозильного

остатка идет на невосстанавливающий КОнец молекулы синтезируемого поли­

сахарида. Эта реакция может повторяться многократно, что обеспечивает

ступенчатый синтез молекул полисахаридов, содержащих orpOMHoe число

остатков моносахаридов. Характерная особенность реакций Taкoro типа со­

стоит в необходимости затравки, т. е. наличия в реакционной среде небольшого

количества молекул полисахарида. ОН как бы предопределяет тот тип связи,

который ВОЗНИICает в процессе трансгликозилирования, и, следовательно, син­

тезируется полисахарид, одноименный с «затравочным». Роль затравки при

биосинтезе некоторых разветвленных полисахаридов, такиХ, например, как

частичковый гликоген, могут шрать полнпеmидные цепи (см. рис. 104), содер­

жащие олигосахаридные звенья.

Установлено, что при биосинтезе различных полисахаридов субстратами (а

точнее, коферментами соответствующих трансгликозидаз) служат p83ныe

IЩФ-сахара. Так, целлюлоза образуется с помощью гуанозиндифосфатглюко­

зы, полисахарид дрожжей (маннан)-с помощью гуанозиндифосфатманнозы

366

УРИl1ИИАифосфат глюкоза

+

CI-I,4-Глюкаи, содержащий в молекуле на ОАИН

остаток глюкозы больше

и т. п. В связи с этим по-новому встает вопрос о специфичности реакции

биосинтеза полисахаридов. Нуклеотидная часть НДФ-сахаров-это, по мне­ нию Н. К. Кочеткова, «рукоятка», при помощи которой фермент располагает

определенный сахар в нужном для осуществления реакции положении; она

нужна также для «узнавания» гликозилтрансферазой соответствующего НДФ-

сахара. ,

Конкретным представителем гликозилтрансфераз' этого типа может слу­ жить Пlикогенсинтетаза. Она открыта л. Лелуаром и СОТР. (1957) в печени

крысы, а сейчас обнаружена у многих животных и микроорганизмов. ThMoreH-

агрегирует. Соединяясь с гликогеном, образует комплексы с M=S-6 МЛН.,

содержащие до 10 молекул фермента, локализованных по месту нередуциру­ ющих JЮНЦОВ наращиваемых олигосахаридных цепей.

Активность гликогенсинтетазы регулируется за счет реакций фосфорилиро­

вания (снижение) и дефосфорилирования (возрастание). Предполагают, что ее

367

фосфорилирование осуществляется той же цАМФ-зависимой протеинкиназой,

'по и фосфорилирование гликогенфосфорилазы. Это подчеркивает весьма

тонкие взаимоотношения систем, регулирующих синтез и распад гликогена.

Донором гликозильных остатков при синтезе полисахаридов могут слу­ жить и олигосахариды. Изучены реакции переноса остатков глюкозы на

растущий конец цепи синтезируемого полисахарида с мальтозы, сахарозы

и.других олигосахаридов. Реакция аналогична описанной выше. Однако раз­ нообразие типов связей, которые могут возникать при переносе гликозильных

остатков с олигосахаридов на новообразуемый полисахарид, гораздо больше. Здесь перенос может идти не только на 4-й, но и на 6-й углеродный атом

остатка моносахарида, что обеспе<J:ивает синтез 1,6-глюканов, а возможно,

иполисахар~дов разветвленного строения.

Впоследнее время внимание привлечено еще к одному источнику глико­ зильныIx И олигосахаридных остатков при биосинтезе полисахаридов и особен­ но полисахаридной части гликопротеинов и гликолипидов. Это-полиизо­

превилмонофосфат и дифосфатсахара, называемые также долихолфосфат и до­

лихолдифосфатсахарами (от названия пЬлиизопреноидного спирта-долихола,

с числом изопреноидныx остатков от 6 до 24). Особенно хорошо эти соеди­

нения представлены у микроорганизмов, хотя они, несомненно, принимают

участие в новообразовании гликопротеинов у животных и растений:

СН2ОН

н

н

ДолихолмонофосфаТГЛЮКОЗ8 (n-18-23)

Встраиваясь полиизопреноидной частью в липофильную мембрану, они

обеспечивают беспрепятственную переброску моносахаридных звеньев для достройки олигосахаридных фрагментов пептидогликанов и гликолипидов, происходящую при помощи соответствующих гликозилтрансфераз.

Особое значение реакции синтеза полисахаридов при участии долихолфос­

фатсахаров имеют для сборки пептидоглюканов клеточных стенок бактерий.

Именно при их участии идет перенос углеводны x фрагментов на пептидные

грушшровки новообразуемого пептидоглюкана. Новым аспектом является участие доли~олдифосфатолигосахаридов в N-гликозилировании белков при их посттрансляционной модификации..

Для реакций синтеза полисахаридов характерно также, что осуществляется перенос не только остатков моносахаридов, но и полигликозидныIx фрагментов с одного полисахарида на другой или же в пределах одной и той же молекулы.

Реакции этого типа изучены у нас А. Н. Петровой и ею же впеРВЬJе получен из скелетных мьшщ кролика гомогенный препарат соответствующего фермента

(1970).

Примером может служить перенос части полиглюкозидной цепи у 1,4-

глюкана из положения 4 в положение 6, катализируемый а-l,4-глюкан-вет­

вящим ферментом, систематическое название которого-а-l,4-глюкан: а-l,4-

глюкан 6-а-(а-l,4-глюкано)-трансфераза. По данным А. Н. Петровой, этот фермент для осуществления реакции ветвления полисахарида нуждается в при­

сутствии РНК с М ~ 10000. Нуклеотидный состав и первичная структура этой

РНК (31 н. о., из них 1/3 минорных) изучены, хотя механизм активирования

ею фермента до конца не ясен. Мнение о том, что она является рибозимом, оказалось ошибочным.

368