Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии

Кроме того, ей присуща экзодезоксирибонуклеазная активность в отноше­

IПIИ одноцепочечной ДНК в направлении 3'-+5', т. е. тоже со стороны кон­ цевого дезоксирибонуклеозида, а также в направлении 5'-+3' со стороны начального дезоксирибонуклеотида молекулы. В l-м случае достигается уда­ ление с наращиваемого в процессе синтеза ДНК 3'-конца молекулы неправиль­

но (ошибочно) присоединенных нуклеотидных остатков, во 2-м-разрушение

праймера, необходимого для синтеза фрагментов Оказаки (см. ниже). Послед­

нее очень важно. Так, у мутантов кишечной палочки, утративших эту функцию

ДНК-полимеразы 1, накапливаются фрагменты Оказаки и биосинтез ДНК

приостанавливается. Сейчас полагают, что ДНК-полимераза 1 имеет большее отношение к «созреванию» реплицирующейся ДНК, нежели непосредственно к полимеразным процессам в репликационной вилке. Последняя функция более присуща ДНК-полимеразе 111. .

ДНК-полимераза 11 присутствует в клетке кишечной палочки в количестве

около 40 молекул (М = 90 0.00). Она представлена одной полипептидной цепью. ДНК-полимераза 11 плохо соединяется с одноцепочечными ДНК, но отлично

оккупирует точки разрыва в одной из цепей биспиральной ДНк. Обладает лишь lО%-ной ДНК-полимеразной активностью по сравнению с ДНК-поли­ меразой 1.

Считают, что основной функцией ДНК-полимеразы 11 является достраива­

ние поврежденных участков в молекуле ДНК, т. е. репарация ДНк. Предпола­

гают, что ДНК-полимераза 1 in vivo несет эту же функциональную нагрузку.

Главной полимеразой кишечной палочки является ДНК-полимераза 111.

Это-сложный, термолабильный белок (М=300ОО0), состоящий из субъеди­

ниц сх (140000), 13 (37000), у (52000), о (32000), Е (25000) и 0 (10000);

полимеразную реакцию осуществляет каталитический кор из сх-, Е- И 0-

су6ъединиц, В котором главную роль играет сх-субъединица; J3-, у- и о-субъеди­

ницы являются регуляторными и усиливают действие каталитического ядра ДНК-полимеразы 111. В клетке кишечной палочки всего 20 молекул этого белка. Именно ДНК-полимераза ПI ответственна у кишечной палочки за

процесс репликации ДНК. Она работает в ее клетке в комплексе с белковыми факторами, тоже принимающими участие в репликации ДНК, полностью обеспечивая главную ступень ее биосинтеза-элонгацию (продолжение) сбор­ ки дезоксиполирибонуклеотидной цепи.

Не менее сложен вопрос о ДНК-полимеразах эукариот. Их номенклатура оказалась крайне запутанной, поэтому на международной конференции по

ДНК-полимеразам эукариот (США, 1975) она была унифицирована; услови­

лись называть их ДНК-полимеразы-сх, -13 и -у.

ницы. Это- кислый белок (pI 5,5), сильно ишибируемый агентами, блокиру­ ющими НS-группы. Ее полимеразная активность максимальна при рН 7,2

в присутствии биспиральной ДНК, но не АТ-кополимера. Хотя она и об­

наруживается в цитоплазме, ее истинная локализация - в ядре, где сосредото­

чено -25000 ее молекул.

ДНК-полимераза-f3 (М =45 000) характеризуется устойчивостью к действию

агентов, блокирующих НS-группы, хорошо выраженной способностью уско­

рять при рН 8,4 реакцию копирования и ДНК, и АТ-кополимера, является основным белком (pI 9,2). В клетке содержится в количестве -8000 молекул, локализованных в ядре и участвующих в репарации ДНК.

ДНК-полимераза-у-кислый белок (pI 5,8) с М= 180000, тетрамер из иден­ тичных субъединиц; ее полимеразная активность. зависит от целостности

250

НS-групп. При рН 8,5 энергично ускоряет репликацию АТ-кополимера и гора­

здо менее активна с природной днк. В клетке присутствует в количестве

'" 1000 молекул, локализована в МИТОХОНДриях, где обеспечивает репликацию

митохондриальной днк.

НИ одна из ДНК-полимераз эукариот, в отличие от таковых прокариот,

не обладает нуклеазной активностью. Их биологические функции выяснены

пока недостаточно. Механизм действия ДНК-полимераз представлен на рис. 83.

Кроме ДНК-полимераз, обладающих у прокариот к тому же нуклеазной активностью, в биосинтезе ДНК принимает участие ДНК-лигаза. Она открыта

в 1967 г. одновременно в пяти лабораториях. Это белок с М =96000. В клетке

кишечной палочки, например, насчитывается около 2000 молекул ДНК-лига­

зы. Ее функция состоит в обеспечении каталитического ускорения реакции

образования фосфоДиэфирной связи между 3'- и 5'-концами цепей ДНК, сближенных на расстояние одного нуклеотидного звена и закрепленных на комплементарной им, но непрерывной другой цепи ДНК. Такая ситуация

возникает во многих случаях: при устранении разрывов в одной из цепей ДИК,

вызванных облучением, действием нуклеаз и т. п.; при соединении новооб­ разованного при репарации или в процессе нормальной репликации фрагмента

с предшествующими или вновь созданными при этом фрагментами ДНК; при

ковалентном замыкании линейной молекулы ДИК в кольцевую структуру и т. п. Механизм ДНК-лигазной реакции представлен на рис. 84. ДНК-лигаза нашла применение в работах по синтезу генов и их фрагментов.

Белковые факторы, иеобходимые для биосинтеза ДИК. Наряду с перечис­

ленными выше ферментами в биосинтезе ДНК принимают участие белковые факторы, каждый из которых выполняет собственную функцию. .

ДНК-связывающий белок впервые выделен В. Альбертсом и Л. Фреем (1970) из лизатов кишечной палочки, зараженной фагом Т4. Вначале он был

назван белком 32 - по номеру гена в хромосоме фага Т4, ответственного за

биосинтез этого белка. Белок характеризуется молекулярной массой 35000

(собственный ДНК·связывающИЙ белок кишечной палочки имеет М =22000), высокой степенью асимметрии молекулы (Ь/а=А), преобладанием дикарбоно­

вых аминокислот над диаминокислотами. Белок представлен одной полипеп­

тидной цепью и обладает ярко выраженной способностью связываться с одно­ цепочечной ДНК или дефектными участками биспиральной ДНК, резко осла· бляя взаимодействие полидезоксирибонуклеотидных цепей в ее молекуле, что

выражается в понижении температуры плавления ДНК на 30-400.

ДНК-связывающий белок активирует ДИК-полимеразы 11 и 111. Сейчас он

выделен и из клеток эукариот. В противоположность ДНК·связывающему белку существует и выделен белок, биосинтез которого у кишечной палочки

кодируется геном NQ 5 фаговой хромосомы. Этот белок полностью блокирует матричную активность ДИК, т. е. является антагонистом ДИК-связывающего

белка.

ДНК-раскручнвающий белок описан Дж. Яшом (1971) и назван белком ю. Предполагают, что он обладает нуклеазной активностью и, присоединяясь

к ДНК, разрывает фосфодиэфирную связь одной из ее цепей, вследствие чего обеспечивается свободное вращение вокруг фосфодиэфирной связи другой

цепи и раскручивание·сynерспиральной молекулы ДНК. Его антагонист­

ДНК-закручивающий белок вызывает суперспирализацию ДНК, ему присущи ДИК-зависимая АТФазная аКтивность и механохимические свойства.

При изучении биосинтеза ДНК у кишечной палочки и ее мутантов тести­ ровано еще несколько белков, участвующих в репликации ДНК (рис. 85), и функции некоторых из них уже выяснены. Среди них особый интерес

251

I

(CH )CNH-o-t-й-CH2 А+РР

А

ПI

Рис. 84. Механизм ДНК-лиrазной реакции

Реакция идет в три стадии: l-ДНК-лигаза взаимодеiiствует с АТФ (или НАД+) с образованием ферментадепилатного производ­

иого по E-NH 2-rpynne остатка лизина полипептидной цепи фермента и выделением пирофосфата (или иикотинамидрибозофос­ фата); 1I-0статок адениловой кислоты с крайне активной в химическом отношении аденилатлигазы перебрасываеТСJl на

свободную фосфатную группу 5'-углеродного атома рибозы концевого нуклеотида; днк-лигаза при этом высвоБОJl(Д8етси;

111-меЖJJ;j сближенными активированноii аденилатом 5'-фосфатной группой и З'-mдроксильной ГPJIппой фрагментов цепи ДНК

происходит спонтанное взаимодействие с образованием фосфоднэфирной связи С выделеиием АМФ

252

представляет хеликаза-фермент, расплетающий двойную спираль днк. При молекулярной массе около 75000 Да его полипептидная .цепь из 650 амино­

кислотных остатков (первичная структура выяснена) организована в виде двух

крупных доменов из 286 и 364 аминокислот (в каждом по 2 субдомена)

ипространственно организована так, что может охватывать биспиральную

молекулу ДНК, расплетая ее за счет энергии распадающейся АТФ.

Этапы биосинтеза дик. Исходя из приведенных выше данных о ферментах

ибелковых факторах, принимающих участие в биосинтезе ДНК, постулирова­

на схема этого процесса. Она базируется на представлении о существовании репликативного комплекса ферментов и белковых факторов, необходимых для

осуществления биосинтеза ДНК, локализованных в репликативной вилке, т. е.

той зоне ДНК, где происходит распаривание биспирального полидезоксири­ бонуклеотида и сборка дочерни~, новообразуемых цепей ДНК (рис. 85); В со­ ответствии с этой схемой биосинтез ДИК распадается на 3 этапа: инициацию,

элонгацию и терминацию. Следует подчеркнуть, что многие вопросы, каса­

ющиеся механизма биосинтеза ДНК, еще не до конца выяснены и рассмат­

рцваемая модель является в определенной мере условной.

Инициация биосинтеза ДИК, понимаемая в узком смысле как начало био­

синтеза дочерних полидезоксирибонуклеотидных цепей на материнских, сво­ дится к созданию на материнской цепи ДНК затравочного олигонуклеотида со свободной гидроксильной группой на 3'-конце этого олигонуклеотида. Без него не работает ни одна из ДИК-полимераз. Этот короткий (несколько десятков звеньев) олигорибонухлеотид, заканчивающийся пиримидиновым нуклеозидом, является праймером, т. е. предшественником будущей цепи ДНК, и синтезируется при участии фермента типа РНК-полимеразы, получи­ вшего название праймазы (М=60000, 100 молекул в клетке кишечной палоч­

ки). Только после его создания· в синтез включается ДНК-полимераза 111, при

посредстве которой синтезируется далее на материнской цепи ДНК дочерняя

цепь ДНК. Впоследствии ковалентно присоединенный К этой новообразован­

ной цепи ДНК фрагмент РНК (праймер) «вырезается» при помощи нуклеаз

и одноцепочечная брешь застраивается олигодезоксинуклеотидным фрагмен­ том тоже при посредстве ДИК-полимеразной (репаразной) реакции (рис. 85).

Инициация биосинтеза ДНК, понимаемая в более широком смысле как комплекс процессов, приводящих к старту в биосинтезе ДНК, сводится к воз­

никновению репликативного комплекса ферментов и белковых факторов

и формированию репликативной вилки (рис. 85). Она включает присоединение к биспиральной ДНК (к одиоцепочечному ее фрагменту в момент распарива­ ния биспиральной структуры в результате флуктуаций) ДНК-связывающего белка, ДНК-раскручивающего белка, ДНК-полимеразного комплекса, ДИК­ зависимой РНК-полимеразы (праймазы), а также комплекса белковых факто­

ров, называемого праймосомой и обеспечивающего продвижение репликатив­

ной вилки (рис. 85), ее пространственную организацию и функционирование. Элоигация биосинтеза ДИК складывается по меньшей мере из двух процес­

сов: репликации участков материнских цепей ДИК и соединения друг с другом

синтезированных при репликации фрагментов новообразуемых цепей ДИК

Первый осуществляется при посредстве ДНК-полимеразной реакции (см. рис. 83), идущей со скоростью (в н. о.{с) В среднем около 1000 у бактерий, l00-у животных и 10-у растений. Своеобразие его состоит в том, что репликация идет не непрерывно, а фрагментарно: за один раз у прокариот синтезируется полидезоксирибонуклеотид С коэффициентом седиментации 8 - 10S, Т.е. молекулярной массой в несколько сотен тысяч дальтон (примерно из 1000 н. о.). У эукариот фрагменты Оказаки короче, около 200 н. о., что сопо­

,-тавимо с длиной нуклеосомной ДНК, в чем, по-видимому, есть определенный

253

11, 11'.11-. , ·КОМПЛ91:

--'''.onJl' - dмC -XOМJJJIoc

А

ICclмuпea:c, IIМIO'IIIOщиI хе.лииазу,

пpdмосому в прaltмa3y

дик- DOIIJDIeJ'131I

(репараза)

ЗaJOВЧеJlllblC фplnaeJI'I'Ы on_п дo'I1IрИОI II.011J1 дик

Б

254

смысл. Этифрагментыполучили название фрагментов Оказаки в честь японского

биохимика, впервые в 1967 г. на VII Международном биохимическом конгрессе

вТокио предложившего схему биосинтеза ДИК, в которой были преодолены

трудности, ·связанные с антипараллельностью цепей ДНК в ее биспиральной

молекуле. Дело в том, что ДНК-полимеразы способны наращивать полинуклео­

тидную цепь в направлении только 5'-t- 3', т. е. путем переноса нуклеотидного остатка с дезоксирибонуклеозидтрифосфата на гидроксильную группу 3'-угле­

родного атома растушей полидезоксирибонуклеотидной цепи. Ио так как цепи

материнской ДНК антипараллельны, т. е. направление чередования нуклеотид­

ных звеньев в них противоположно (см. рис. 85), то один и тот же фермент, т. е. ДНК-полимераза, не может обеспечить сборку дочерних цепей одновременно

внаправлениях 5' -+3' и 3'-+5' в соответствии с перемещением репликационной

вилки при расплетании биспиральной молекулыI ДИК. Т. Оказаки предположил, что ДИК-полимераза ведет синтез ДИК челночным способом: сначала передви­

гаясь вперед в направлении 5'-+3' по одной цепи, а затем в том же направлении

5' -+3', но передвигаясь в обратную сторону по другой цепи. Те фрагменты

Оказаки, у которых олигорибонуклеотидные праймеры заменены при участии

ДИК-полимеразы 1 на дезоксирИбонух.леотидные фрагменты, при посредстве

ДНК-лигазы объединяются вместе (см. рис. 84 и85) идают начало дочерней цепи ДИК. Есть идругой взглядна механизмпреодоления антипараллельностицепей ДИК; суть его ясна из рассмотрения рис. 85, Б и легенды к нему.

Вопрос, синтезируются ли на одной из цепей родительской ДИК фрагменты

Оказаки, т. е. идет ли на ней прерывистый биосинтез цепи дочерней ДИК, а на

другой-непрерывный биосинтез цепи дочерней ДИК, остается дискуссион­ ным. Видимо, как правило, происходит прерывистый синтез на обеих цепях

родительской ДИК, а сочетание прерывистого и непрерывного является ис­

ключением~ вполне доказанным для репликации некоторых фаговых ДИК. Решение проблемы одноили двунаправленной репликации однозначно: от

точки инициации репликационные вилки распространяются по биспиральной молекуле ДИК в двух противоположных направлениях.

По поводу терминацин биосинтеза ДИК мнения разноречивы. Предполага.

ют, что прекращение репликации ДИК программируется особой нуклеотид­

ной последовательностью, в том числе в виде специальных палиндромов «<Кроличьих ушей») на конце хромосомы. Само собой разумеется, что репли­

кация прекращается, когда встречаются две реплик:ационные вилки при удвое­

нии как кольцевых, так и линейных ДНК. Иаконец, возможно достраивание ведомой цепи за счет праймирования 3'-конца материнской цепи с участием

специфического белка, находящегося на ее конце.

Точцость репликацин ДИК весьма велика-одна ошибка ва 1010 нукле­

отидилтрансферазных реакций. Ио даже если ошибка допушена, она может

быть исправлена в ходе репарационных процессов.

Биосинтез ДИК иа РНК в качестве матрицы. Кроме рассмотренного выше

механизма биосинтеза ДИК на полидезоксирибонуклеотидной матрице в по­

следние годы открыта система биосинтеза ДИК ~a РНК при посредстве

Рис. 85. Схема биосинтеза фаговой ДИК в )(Летке кишечной палочки:

А-плоскостная модель. согласно которой синтезу затра8ОЧВОГО олиrориБОН)'ЮIеотвда (праllмера) под деlicnи... ДНК-заJВСИ. "ой РНК·полимеразы (праllмазы) способствует белJC08ы11 хоммекс, вазыааемыll праllмОСОМОЙ (n-2S ..Да, n,-75 w.дa. К'-

11 .:Да, !<Да, dnaB-ЗОО "Да, "Да). даи",yщиllся 8 направлении. nPОТИВОПОЛОЖIIом элонгации. 11 1jQ3Д11iOш.иI

!lOBble центры сивте1ll прЗЙмера. РаСКРУЧlIвание бисuиpальноll ДНК на одиоцепочечные ПО.IIIIДeЗо.:сириБОИYUICOТllдW ОСУЩ8CПJIJI­

ете. хеликазоll (от англ. he/ix-cnираль), а релаlCсацНII суперспиральной ДНК-гиразой (от аигл. gy,a/iOll-JCругловpawaТOJIWI08

движеиие). Б-пространствеЮlIUl модель, демонстрирующа" преодоление автипараллельиости цепей ДНК 111 счет 1IQ3I11JП!О8СИИ"

петли ДНК, где чередованне фосфоридИэфирных св.... на ее восходящем отре• .:е изменяете" на обратное в lIe преп"тет.)'ет ДНК.полимера.е вести сию'ез фрагмента Оuзакя 118 ведомой цепи родительской ДНК в том же напраJlлении, что и lIa lIOДYIдей

цеПII. Остал..иwе ПОllCВеlПIJl 8 тексте

25S

фермента, названного обратной транскриптазой или ревертазой (его называют

также РНК-зависимой ДНК-полимеразоЙ). Этот фермент был обнаружен в 1970 г. независимо друг от друга Д. Балтимором в составе вируса Раушера

лейкемии мышей и Г. Теминым и С. Мизутани в составе вируса саркомы Рауса.

Ревертаза активируется Мп2 + сильнее, чем Mg2 +, и содержит Zn2 • Синтезиро­

ванная ДНК имеет небольшую молекулярную массу и характеризуется конста­

нтами седиментации от 2S дО 7S. Как и обычные ДНК-зависимые ДНК­

полимеразы, ревертаза нуждается в праймере, роль которого может играть

тРНК, в чем проявляется регулирующая роль последней в обмене веществ. Ее

молекулярная масса колеблется от 70 до 180 кДа в зависимости от объекта, из которого она выделена; фермент, как правило, состоит из двух субъединиц.

Значение открытия ревертазы состоит прежде всего в том, что выявлен дополнительный механизм биосинтеза ДНК, которыI,. как предполагают,

может использоваться для амплификации генов. Исследование ревертазной

реакции крайне существенно для изучения перерождения нормальной клетки в раковую. Ревертаза нашла применение в мрлекулярной биологии для син­ теза генов и фрагментов генов и, как следствие этого, в генетической ин­

женерии. Новой областью ее использования является массовая расшифровка

через кДНК первичной структуры РНК и белков.

Учитывая исключительную важность работ по исследованию обрачюй

транскрипции, в нашей стране начиная с 1972 г. осуществляют проект «Ревер­ таза», в разработке которого принимали участие академии наук СССР и стран

СЭВ. В результате проведенных исследований удалось создать универсальную

систему обратной транскрипции, позволяющую вести синтез ДНК с любой

заданной точки в молекуле РНК при помощи синтетического праймера (ок­

тадезоксирибонуклеотид заданного строения), комплементарного межгенной зоне одной из фаговых РНК. Кроме того, путем ревертазной реакции получена ДНК на глобиновой мРНК голубя и гигантских ядерных рнк. Действие~

ревертазы in vivo в ДНК введена онкогенная информация, успешно изучается

структура РНК-содержащих опухолеродных вирусов, синтезированы потенци­ альные ингибиторы ревертазы.

Продолжаются интенсивные работы по изучению свойств ревертаз, выде­

ленных из различных опухолеродных вирусов (в том числе человека), синтезу

ингибиторов ревертаз, не действующих на клеточные ДНК-полимеразы, полу­

чению ДНК-транскриптов для работ по генетической инженерии, исследова­ нию интеграции ДНК, синтезированной на вирусной РНК, в геном клетки.

За этот цикл работ группе советских исследователей и ученых стран СЭВ

в 1979 г. присуждена Государственная премия СССР. Начиная с 1980 г. проект «Ревертаза» преобразован в проект «Ревертаза-онкоген».

Биосинтез РИК. Биосинтез РНК осуществляется на ДНК в качестве матри­ цы. С точки зрения передачи информации в живых системах он характеризует­

ся как процесс транскрипции, т. е. переписьmании информации, содержащейси

в последовательности нуклеотидных остатков в ДИК-матрице, в последователь­ ность нуклеотидных звеньев в молекуле новообразуемой РИК. Та часть молеку­ лы ДНК, которая копируется в процессе биосинтеза РНК на ней, носит

название транскриптона. Последний содержит информативную и неинформа­

тивную зоны. Транскрибирование информативной зоны приводит к образова­

нию той части новообразуемой РНК, которая впоследствии дает начало РНК с определенной функциональной активностью. При копировании неинформа­

тивной зоны продуцируется та часть насцентной РНК, которая впоследствии, в процессе созревания вновь синтезированной РНК, разрушается. Соотноше­

ние информативной и неинформативной частей в транскриптонах прокариот и эукариот резко различно и составляет 'в среднем 9: 1 и 1:9 соответственно.

256

Неинформативная зона транскриптона содержит регуляторные последова­

тельности, с которыми взаимодействуют многочисленные (их открыто не­ сколько десятков) регулиторные белковые факторы, ускоряющие или замедля­

ющие процесс транскрипции. Они контактируют с определенными последова­ тельностями нуклеотидных остатков в ДНК присущими им ДНК­ связывающими доменами. Так, например, транскрипционный фактор IIIA из

обеспечивающий прикрепление к ДИК.

у эукариот основная масса РНК синтезируется в ядре клетки, где локали­

зация биосинтеза различных видов РНК также различается (рис. 86)_ Биосинтез РНК осуществляется при посредстве РИК-полвмераз, которые

в основном являются ДНК-зависимыми и лишь в некоторых случаях РНК­

зависимыми ферментами. Механизм их деЙСТВИ8 во многом совпадает с тако-

вым У ДНК-полимераз: они ускоряют биосинтез' РНК из АТФ, ГТФ, ЦТФ

и УТФ тоже путем нуклеотидилтрансферазной реакции. Обеспечение уникаль­

ной первичной структуры новообразуемой РНК происходит за счет спарива­ ния соответствующего рибонухлеозидтрифосфата с комплементарным ему

нуклеотидным остатком матричного полинуклеотида в точке роста молекулы

рнк. НО есть существенные различия: РНК-полимеразы не нуждаются в прай­

мере, обладают способностью избирательно взаимодействовать с зоной про­

мотора ДНК (точка, с которой начинается биосинтез РНК), являются слож­ ными молекулами, построенными из нескольких субъединиц, и др.

Наиболее изучены РНК-полимеразы прокариот, в частности кишечной

а. Форма субъединиц, их молекуЛярные массы и вероятный вариант ком­

поновки показаны на рис. 46.

В целом же у прокариот (изучено несколько десятков видов) молекулярные

массы РНК-полимераз колеблются в довольно широких пределах (сх: 36-45

кДа, 13: 86-160 кДа, 13': 96-175 кДI1 и а-фактор: 44-107 кДа). Прокари­

отические РНК-полимеразы синтезируют все виды РНК-рибосомальные, матричные, транспортные и низкомолекулярные. В отличие от них эукари­

отические РНК-полимеразы типа 1 (М =473 кДа, 6 субъединиц) транскрибиру­ ют гены рРНК; типа 11 (М=882 кДа, 10+2 субъедиющы)-гены, кодирующие

белки; типа 111 - гены малых стабильных РНК (тРНК, 5S рРНК) (М"",653 кДа, 9 субъединиц). Каждая из субъединиц РНК-полимераз выполняет свою функ­

цию: одни из них узнают нуклеотидную последовательность в зоне промото­

ра, обогащенную тимидиловыми и адениловыми деЗОlCсирибо­

нуклеотидами (ТАТААТ-блок Прибнова у прокариот, ТАТА-блок Гольдбер­

га-Хогнесса у эукариот), другие обеспечивают нуклеотидилтрансферазную

реакцию при наращивании цепи РНК, третьи-взаимодействуют с многочис­

ленными транскрипционными белковыми факторами (их насчитывают уже несколько десятков), регулирующими биосинтез соответствующих РНК путем

контакта с энхансерными (усиливающими) и сайленсерными (ослабляющими)

полинуклеотидными зонами ДНК или путем аткивирования протеинкиназ,

фосфорилирующих как белковый кор РНК-полимераз, так и регуляторные белки. Транскрипционный процесс завершается либо факторнезависимым спо­

собом (в составе синтезируемой РНК поблизости от ее конца появляются дВе

короткие последовательности, дающие шпильку, что выводит РНК из транс­

крипционной вилки), либо· при посредстве беЛКQВОГО фактора р (М =46094 Да,

первичная структура выяснена, существует в виде гексамера в количестве 1000

молекул на клетку), который присоединяется к транскрипционному центру. распаривает ДНК-РНКовый комплекс и высвобождает рнк. ДЛЯ РНК­

полимеразы 1, осуществляющей транскрипцию рРНК, сигналом для ее завер­ шения служит присоединение белкового фактора (М= 130 кДа) к 18-звенному

терминатору в составе копируемого гена рДНК млекопитающих.

РНК-полимераза преимущественно связывается с тяжелой цепью ДНК и об­

ладает способностью расплетать биспиральную структуру ДНК на ее ограничен­ ном протяжении. Перемещение РНК-полимеразы вдоль цепи РНК происходит

под воздействием присоединяемого в процессе синтеза РНК нуклеотида. Биосин­

тез РНК регулируется при посредстве механизма, показанного на рлс. 87.

Синтезированные РНК представляют собой РНК-предшественннкн функ­

ционально-активных рибонуклеиновых кислот, так как наряду с информатив­

ными зонами содержат неинформативные участки. Впервые это явление было

открыто в начале 60-х годов г. п. Ieоргиевым и о. п. Самариной, а сами эти

гигантские транскрипты названы ими дРНК (т. е. ДНК-подобными РНК).

В дальнейшем происходит процесс их видризменения, сопровождающийся разрушением неинформативных зон. Он носит название процессИШ'а или созре­ вания рнк. При процессинге РНК метилируется (с помощью РНК-метилаз),

в результате чего она обогащается минорными основаниями (особенно в слу­

чае тРНК); в случае мРНК " ней присоединяются кэп и полиаденилатный

фрагмент. Процессинг идет при участии разнообразных ферментов. Именно при изучении процессинга предшественников РНК было открыто удивитель­

ное явление: способность векоторых визкомолекуJUJРВЫХ РНК осуществлять катаJШIвческую функцию.

Наиболее отчетливо это выявилось при работе с РНКовой компонентой

рибонуклеазы Р-фермента, катализирующего процессинг 5'-концов предшест­ венников тРНК: будучи отделена от белковой.части, РНК оказалась способной ОдНа ускорять реакцию распада фосфодиэфирной связи по гуаниловому остатку

при переходе предшественника в зрелую тРНК (рис. 88, А), вследствие чего

получила название рибозима. Механизм :каталитического акта пока не ясен, но зафиксировано образование рибозим-субстратного комплекса и полное подчи­ нение процесса ферментативной :кинетике. Возможен и аутосплайсинг предщест­

венников (рис. 88, Б), где тоже решающую роль играют гуанозиновые остатки.

В последние годы предприняты попытки по замене рибонуклеотидов в составе рибозимов на дезоксирибонуклеотиды, что привело к созданию химерных

рибозимов (нуклеозимов) с повышенной стабильностью и активностью, а также

258

Выяснилось далее, что аналогичной способностью обладают многие малые ядерные РНК, сyrцествуюrцие в виде КОМШIексов с белками. Все они содержат

много остатков уридиловой кислоты и получили поэтому шифр Ul, U2 и т. д.

РНК. их изучено более десятка, и большинство из них принимают участие

вкаталитическом ускорениисозревания мРНК ирРНК, обеспечиваявьпцепление

неинформаmвныхфрагментовизихпредшественниковисоединение (СWIайсирова­ lDIе) биологически значимыхпоследовательностейсобразованиемзрелыхмолеl\YЛ. Они же, по-видимому, ведутальтернативныйСWIайсингпредшественниковмРНК,

прикоторомиз однойпре-мРНК образуется несколько функционально значимых

мРНК засчетразного расположенияинформативныхзонвихсоcrаве. Внутриядер­ ные комплексы низкомолекулярных ядерных РНК с белковыми факторами, необходимымидляихсборки и функционирования, получилиназваниеСWIайсосом;

именно они осуществляют'специфический сплайсинг при созревании пре-мРНК

и пре-рРНк. Сейчас на первый план при оценке функций малыIx ядерных РНК выступает их ведyIЦая роль в регуляции обмена BeIЦecтв в клетке: открыт новый

класс их, представители которого комплементарны коротким диспергированным

повторам в ДНК, вследствие чего они могут контролировать репликацию ДНК

и ее транскрmrцию в качестве tpahc-реryляторных элементов, взаимодействуюIЦИX

с знхансерами и сайленсерами промоторной зоны.

Осyrцествлены подсчеты скорости синтеза РНК. Так, в случае биосинтеза

в клетках печени крысы мРНК для сывороточного альбумина она равна

90-100 н. о.{с. Исходя из того, что в печеночной клетке содержится около 40000 молекул этой мРНК, а время ее жизни составляет 3 ч, при указанной скороcrи биосинтеза достаточно 3-4 активных генов для того, чтобы полно­

стью обеспечить наработку ее необходимого количества.

Изучение закономерностей биосинтеза нуклеиновых кислот привело к от­ крытию важнейшего механизма воспроизведения специфичности при их ново­

образовании. Механизм этот сводится к взаимодействию комплементарных

оснований полинуклеотидной матрицы (на которой идет специфический син­

тез) и нуклеозИДтрифосфатов, из которых указанный сюггез осyrцеcrвляется.

Thким образом, принцип комплементарности оказался ведуIЦИМ не только

в строении нуклеиновых кислот, но и в их биосинтезе. Как будет показано

259