Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии

ТОЧКИ приложеНИR деЙСТВИII cz-амилазы

Б

в

Рис. 103. Продолжение

могут на том или ином протяжении взаимодействовать друг с другом, образуя

вторичные структуры биспирального типа с взаимозакрученными полисаха­

рядными цепями.

Амилопектин имеет сферические молекулы с радиусом вращения от 82 до 255 нм. Их сферическая форма обеспечивается тем, что молекула составлена

из множества (несколько сотен) коротких полигликозидных цепочек, каждая

из которых в среднем содержит 20 остатков а-D-глюкопиранозы. ·в пределах

каждой короткой цепи глюкозные остатки соединены a-l,4-глюкозиДНыми связями. Друг с другом цепи соединяются посредством а-l,6-глюкозидных связей. Строение разветвленного участка молекулы амилопекmна таково:

Амнnопектнн

320

Е

Рис. 104. Строение молекул крахмала и гликогена:

А-амилоза; Б-ами,опектин; B-ГJIИl<оген; каждыЙ КРУЖОК обозначает остаток глюкозы; г­ современная гроздевидная модель молекулы амилопектина (а-kомпахmая. псеВДОkристалличе­ ска. об,асть; б-менее компактная, аморфна. область; ТОЧКОЙ обозначена редуцирующаll группа); Д-модеРНИЗНРОВ8ННВR модель молекулы ГЛИICогена, демонстрирующа.. наличие спрJlтанныx поли­ ГлИ'КОЗИДНЫХ иелей; Е-строение чаСТИЧКDВОГО глихогена; централЬНaJI JIIIНИJI-ПQлипепmднаJl

цепь, к которой через радикалы О:КСИ8МИНОкнслот присоединеиы p-чаcтицы' образующие Cl-частицу.

построенную по типу сложной J:ОСТJПIПI; Ж- объемна. модель фрагмента молеКУЛW амилопектива (Р-редуuирующий конец; Н-нерсдуцирующие коlпIы)

Общаяструктурамолекулы амилопектина в соответствии с раннимиданными

показана на рис. 104, Б. На этомже рисунке приведена более современная модель молекулы амилопектина (1), выведенная на основании детального исследования

продуктов ферментативного гидролиза и рентгенографического анализа этого

полисахарида. Она получила название гроздевuдll0Й, так как по расположению

в ней полигликозидных звеньев весьма напоминает гроздь винограда. Степень полимеризации остатков а.-D-глюкозы в звеньях, обозначеШIЫХ утолщенными линиями, достигает 45, тонкими- r - 15. Протяженность каждой псевдокристалли­ ческой области составляет 6 нм, аморфной- втрое меньшую величину.

ж

Рис. 104. Продолжение

Считают, что в составе амилопектина а.-D-глюкопираноза также находится

в лодкообразной конформации. Вследствие этого отдельные участки полигли­

козидных цепочек, составляющих молекулу амилопектина, видимо, спирализо­

ваны подобно амилозе (рис. 104,ж).

Обе фракции крахмала дают окрашивание с иодом в растворе KI, однако амилоза окрашивается в чисто синий цвет, а амилопектин-в фиолетовый.

Реакция крахмала с иодом .не связана с химическим взаимодействием между

ними, а состоит в образовании комплексов адсорбционного типа. Так как

ведущую роль в возникновении этих комплексов играют спиральные участки

молекул крахмала того или друтого типа, то различие в тональности окраски

вполне естественно. Предполагают, что молекулы иода втягиваются внутрь

полигликозидной спирали, где и замыкаются соответствующие связи, дающие

начало цветным комплексам (рис. 103, в).

При кратковременном нагревании порошкообразного крахмала его гигант­ ские молекулы распадаются, образуя смесь более простых полисахаридов мень­ шей молекулярной массы-декстринов. Декстринизация крахмала при нагрева­

нии сопровождается повьппением его растворимости в воде. Обработанный

таким образом крахмал называют растеоримым. Распад молекул крахмала до декстринов особенно интенсивно идет при нагревании крахмального клейстера

с 10%-ным раствором H 2S04 • При дальнейшей обработке молекулярная масса

декстринов прогрессивно падает и конечным продуктом распада является р­

ГJПOкоза. Крупномолекулярные декстрины окрашиваются иодом в красный ЦJieT,

низкомолекулярные-окраски с иодом не дают. Таким образом, гидролиз

крахмала проходит ступенчато и может быть выражен следующей схемой:

где x>y>z.

322

Декстринизация и осахаривание крахмала широко применяются в спирто­ вой промышленности, при производстве клея и т. д.

Так как крахмал составлен ИЗ оптически активных остатков а-D-rmoкопи- .

равозы, его растворы вращают плоскость поляризации света вправо

([aJD= + 195°).

Dвпcorен служит резервным питательным веществом в организме человека и животных, вследствие чего за ним сохраняется название «животный ICpax-

мал». Однако он найден также в rрибах, дрожжах и зернах кукурузы, что

ставит под сомнение его название «животный». Содержание гликогена в пече­

ни животных достигает 20%, а в мышцах-4%. Распадаясь до простых

продуктов довольно сложным путем, который называется ГЛlIКогенолнзом

(см. с. 351), гликоген обеспечивает потребность организма в энерmи и мета­ болитах. Таким образом, его биологическая роль весьма велика.

Гликоген сравнительно хорошо растворяется в горячей воде, хотя некото­ рые виды натурального гликогена труднорастворимы. Подобно крахмалу,

гликоген дает цветную реВIЩИЮ с иодом, причем тон окраски (красно-фиолето­ вый или красно-коричневый) свидетельствует о том, что гликоген ближе

к амилопектину, нежели к амилозе. Действительно, гликоген и амилопектин

весьма похожи. Так, молекулярная масса некоторых фракций нативного гли­

когена близка к молекулярной массе амилопектина, хотя в целом гликоген в этом отношении отличается крайней гетерогенностью: препараты гликогена

из печени животных содержат фракции с М от 10 млн. до 3 млрд. С преоблада­

нием среди них молекул с М от 200 МЛIL до 600 млн. При неполном mдролизе гликогена образуются декстрины, а при полном-D-глюкоза. Как и амилопе­

ктин, гликоген оптически активен, причем удельное вращение его растворов

(+ 196°) весьма близко к таковому крахмала.

Причины близости свойств гликогена и амилопектина заключаются

в сходстве строения их молекул: оно по существу одно и то же; различие

состоит лишь в том, что в молекуле гликогена средняя длина коротких цепей,

которые сочетаются здесь а-l,6-гликозидными связями, равна -12 остаткам a-D-ГЛlOкопиранозы. Таким образом, молекула гликогена несколько плотнее, компактнее, чем молекула амилопектина (см. рис. 104). Гликоген низших жи­

вотных ближе к амилопектину, так что во MHomX случаях трудно провести

резкую границу между первым и вторым, хотя накапливающиеся данные

оструктуре гликогена (см. рис. 104, Д и Е). определенно свидетельствуют

обольшей симметричности его молекулы, о наличии в ней значительного числа спрятанных (не выходящих на поверхность молекулы) ПОЛНГЛlIКозидных звеньев (это часть звеньев В на рис. 104, д), а также о существовании у глико­

гена макромолекуляриой СТРУХТУРЫ. Последняя характерна для так называ­

емого частичковorо гликогена, впервые выделенного А. Лазаревым (1942)

в мягких условиях методом дифференциального ультрацентрифymрования. Он представлен огромными. глобулами, названными а-частицами (диаметр до

200 им) и напоминающими ягоды шелковицы или малины. В свою очередь, а-частицы составлены из l3-частиц, а те, в свою очередь,-ИЗ 'У-частиц с диаме­ тром 20-40 им (см. рис. 104, Е).

Клетчатка-основной структурный полисахарид растений. Листья содер­ жат 15-30% клетчатки, древесина- 50-70%, стебли волокнистых растений

(например, льна) еще больше, а волокна (волоски на семенах) хлопка пред­ ставляют собой почти чистую клетчатку. Само название этого полисахарида

Подсчитано, что при сжигании всей клетчатки, содержащейся в составе расте­

ний, количество СО2 в атмосфере возросло бы наполовину.

323

Клетчатка отличается очеиь малой растворимостью в подавляющем боль­

шинстве агентов; лишь аммиачный раствор CU(OH)2 и концентрированный раствор Ca(SCN) 2 при нагревании заметно растворяют ее. Устойчивость· клетчатки к действию растворителей объясняют тем, что ее длинные ни­ тевидные молекулы, взаимодействуя друг с другом, образуют прочные мицеллы, которые, в свою очередь, собраны в фибриллы, располагающиеся вдоль оси волокна. Так, тончайшие элементарные волокна хлопка диаметром

20 нм состоят из множества молекул целлюлозы (диаметр 0,6-0,7 нм),

упакованных очень плотио. Отрыв индивидуальных молекул клетчатки от упомянутых устойчивых агрегатов весьма затруднен, и только HeMHome

вещества, способные нарушать межмолекулярные связи в мицеллах, рас­

творяют клетчатку.

При гидролизе клетчатки в присутствии специфического фермента, най­

денного у ряда бактерий, некоторых видов насекомых, плесневых грибков и в прорастающих семенах, образуется целлобиоза. Однако при гидролизе в присутствии кислот почти с количественным выходом возникает I3-D-

глюкопираиоза; она и является основным структурным элементом молекулы целлюлозы:

Целлюлоза

Тип связи остатков друг с другом аналогичен таковому в молекулах

амилозы, но в отличие от последней клетчатка является l3-полигликозидом,

так как остатки глюкозы соединены друг с другом 13-1,4-гликозидными свя­

зями. Как у амилозы, в молекулах клетчатки нет разветвлений, они построены строго линейно, iю намного длиннее молекул амилозы. Число остатков D-

глюкозы в молекуле клетчатки очень велико и достигает нескольких тысяч,

что соответствует молекулярной массе нативной целлюлозы в 10-20 млн.

Эти, на первый взгляд, небольшие отличия в строении амилозы и клетчатки

приводят к резкой разнице в их свойствах.

Более I1Iубоко различие между амилозой и клетчаткой вскрывается при

сопоставлении с'{роения упомянутых полисахаридов с учетом конформации

составляющих их остатков D-глюкозы. Установлено, что Р-D-глюкоnираноза

в составе клетчатки находится в креслообразной коиформации:

Это исключает возможность спирализацни полигликозидной цепи, и молекула

целлюлозы сохраняет строго линейное строение.

Раствор клетчатки в медно-аммиачном реактиве обнаруживает небольшую оптическую активность ([cr]D= 3,21О).

324

Как и у друmх полисахаридов, в молекулах клетчатки остается свободным большое число спиртовых гидроксилов (при 2, 3 и б-м углеродных атомах

каЖдого остатка I3-D-глюкопиранозы). По этим ОН-группам возможны соот­

ветствующие химические реакции. Среди них особенно важны те, что ведут к получению производных, широко применяемых в ионообменной хромато­ графии для разделения аминокислот, пептидов, белков, нуклеотидов и нукле­

иновых кислот. К их числу относятся карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлю­ лоза) и диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЕАЕ-целлюлоза).

КМ-целлюлозу получают, обрабатывая щелочную целлюлозу монохлор­ уксусной кислото~:

в результате целлюлоза обогащается СООН-группами, придающими ей свойства катионообменника.

ДЕАЕ-целлюлозу синтезируют, действуя на целлюлозу l3-хлорэтилдиэтил­ аммоний хлоридом в щелочной среде:

~НО[С6Н904-О-СН2-СН;z-NН(СН2СН3)2]хН+2хNаСl+2хН20

I

Диэтиламиноэтилцеллюлоза

Диэтиламиноэтил-группировки придают ДЕАЕ-целлюлозе свойства аlШ­ онообменника.

.. Декстран-полисахарид, продуцируемый некоторыми видами бакте­

рий. Молекулярная масса его огромна: различные препараты декстрана обнаруживают значения М от 12 млн. до 1 млрд. Молекула декстрана

состоит из сравнительно коротких полигликозидных цепочек по 10-12 остатков а-D-глюкопиранозы в каждой. Остатки сх-D-глюкозы в них (см.

с. 31) соединены cx-l,б-гликозИДными связями, а между собой цепи соединяют­ ся дополнительными 1,4-гликозидными связями. При обработке декстрана

эпихлоргидрином получают сефадексыматериалы, отличающиеся сетча­ той структурой, прекрасно набухающие и используемые в качестве молеку­

лярных сит.

Хитнн- главная составная часть покровных тканей насекомых и рако­

образных. Этот полисахарид широко распространен в природе; подсчитано,

что только крабы ежегодно синтезируют 1 млн. т хитина. Будучи освобож­ ден от белков или СаСО 3, в комплексе с которыми он участвует в построе­ нии покровных тканей упомянутых животных, хитин представляет белое вещество, напоминающее бумажную массу. Хитин отличается очень плохой

растворимостью, и только муравьиная кислота и насыщенные растворы

некоторых солей способны перевести его в частично растворенное состоя­ ние. Видимо, поэтому до сих пор не получено точных данных о молекуляр­

ной массе хитина.

Элементарной структурной единицей хитина является N-ацетил-I3-D­

глюкозамин, соединенный 13-1,4-гликозидными связями в линейную мо­

лекулу:

325

н

н

нNH

I

СОСНа

ХИТИН

Структура хитина, как можно видеть из приведенной выше формулы, весьма напоминает таковую целлюлозы. Рентгенограммы этих двух полисаха­

ридов очень похожи.

Гиалуроновая кислота-важнейшая составная часть межклеточного веще­

ства тканей животных. Особенно высоко ее содержание в коже, стекловидном теле глаза, сухожилиях и т. п. Гиалуроновую кислоту можно получить из указанных тканей путем экстракции разбавленными щелочами, трихлоруксус­

ной кислотой или фенолом. После осаждения из экстракта спиртом гиалуро­

новую кислоту освобождают от прочно связанного с ней белка переваривани­

ем последнего ферментами.

Молекулярная масса mалуроново-белкOJЮГО комплекса достигает несколь­ ких миллионов. Однако препараты гиалуроновой кислоты отличаются сравни­ тельно низкими значениями молекулярных масс (270000-500000). Видимо,

в процессе выделения происходит деградация молекул гиалуроновой кислоты.

Являясь гетерополисахаридом, гиалуроновая кислота содержит в своем

составе две различные структурные единицы-N-ацетил-I3-D-глюкозамин и 13-

,D-глюкуроновую кислоту В отношении 1:1. Они соединены друг с другом попеременно 13-1,3- и 13-1,4-гликозидными связями:

СН2ОН

NH

I

соснз

Гиалуроновая кислота

Thалуроновой кислоте в тканях животных присущи не только структурные

функции. Пронизывая ткани в качестве межклеточного вещества, гиалуроно­

вая кислота регулирует поступление в клетки тех соединений, которые или нужны для жизнедеятельности клетки, или являются ее продуктом. Эта функ­ ция mалуроновой кислоты в значительной степени осуществляется при уча­ стии фермента-гиалуронидазы, свойства которой интенсивно изучаются.

ХОНДРОИТИIIсульфат-непременная составная часть хряща, костной ткани, сухожилий, сердечных клапанов и дрymх подобных тканей животных. Содер­ жание его, например, в хряще носовой перегородки составляет 20-40%.

Хондроитинсульфат выделить в чистом виде трудно, так как онпрочно связан с белком-коллагеном. Вероятно, при выделении идет сильная деградаЦdJ1 молекул хондроитинсульфата, так как молекулярная масса его препаратов не

преВЬШIaет 50000, тогда как М его комплекса с белком составляет от 4 до 50 млн.

В виде очищенного препарата хондроитинсульфат представляет собой белое вещество, распадающееся при гидролизе до глюкуроновой кислоты

326

иN-ацетилгалактозаМИНСУЛLфата, которые соединены друг с другом 13-1,3-

и13-1,4-гликозидными связями, аналогичными связям в mалуроновой кислоте:

NH

I

СОСНз

Хондроитинсу.~Ьфат

Сульфогруппа, связанная с остатком N-ацетилгалактозамина в хондро­

итинсульфате, может занимать также 4-е положение. Эту разновидность хонд­

роитинсульфата обозначают как хондроитинсульфат А. Есть и другие виды хондроитинсульфатов, отличающиеся от указанных выше форм некоторыми

деталями строения.

Ieпарин-специфический гетерополисахарид, препятствующий свертыва­ нию крови у животных и человека. Он обладает также антилипемическим,

антимитотическим и регуляторным по оmошению к ряду ферментов действи­ ем. Гепарин содержится в печени (до 100 мr{KГ ткани), легких, селезенке,

щитовидной железе, крови и, вероятно, в других тканях и органах; он получен

в кристаллическом состоянии. Молекулярная масса гепарина, выделенного из

разных объектов, колеблется от 4000 до 20000. Определения молекулярной

массы гепарина из -разных объектов гравиметрическим, вискозометрическим и гельфильтрационным методами дали более узкие ее пределы: 11 000-12900. Молекула гепарина состоит из остатков гmoкуроновой кислоты и сх-глюкоза­

мина в виде двойного производного серной кислоты:

о

Н NНSОзН Н

Гепарин

Под действием ряда ферментов (гепариназа, дисахаридсульфоэстераза, сульфамидаза, сульфоэстераза и др.) гепарин распадается до составляющих

его структурных элементов и продуктов их деградации, т. е. в конечном счете

до глюкуроновой кислоты И глюкозамина. Период полураспада гепарина

ворганизме кроликов составляет 17,5+6,5 мин, собак-34+13,5 мин.

Внастоящее время широко развернулись работы по выделению, очистке

и изучению состава, строения и функций ряда других гомо- и гетерополисаха­

ридов. К их числу относятся гемицеллюлозы, пектиновые вещества, глюко­

маннаны и галактоманнаны выспrn:х растений, полисахариды водорослей

(агар, каррагинаны, альmновые кислоты, галактаны, маннаны, ламинарии и др.), внеклеточные (ксантан, nyллулан и др.) и капсулярные полисахариды

бактерий и, наконец, полисахариды простейших (парамилон и др.). Как химия,

так и особенно биохимия многих из них представляет большой интерес.

327

ОБМЕН УГЛЕВQДОВ

Нередко функцию углеводов в обмене веществ сводят только к энергети­

ческому обеспечению химических реакций. Это далеко не так. Бесспорно, что при распаде (окислении) углеводов в организме идет высвобождение энергии, которая запасается далее в макроэрmческих связях АТФ, и что АТФ, син­

тезированная сопряженно с окислением углеводов, поставляет энерmю для

осуществления химических процессов и для других нужд организма. Однако

углеводы выполняют еще одну важнейшую функцию в процессе обмена веществони являются источником большого числа органических соедине­ ний, которые служат исходными продуктами для биосинтеза липидов, белков и нуклеиновых кислот. В углеводах, образующихся в процессе первичного биосинтеза органического вещества, связывается углерод и запасается энерmя.

Распад углеводов. Пути распада полисахаридов и дисахари­ Д о в. Полисахариды и олигосахариды распадаются до более простых соедине­

ний посредством реакций двух типов: гидролиза и фосфоролиза. Классическим

примером распада первого типа является mдролиз крахмала, второго -фос­ форолиз гликогена.

Ступенчатый характер пщролиза крахмала рассмотрен ранее. Реакция гид­

ролиза крахмала ускоряется амилазами-специфическими ферментами, относя­

IЦИМИся к подклассу гидролаз гликозидов (класс гидролаз). В зависимости от

характера фермента разрьш гликозидных связей Между остатками а-D-глюкопира­

нозы в молекуле крахмала и присоединение по месту разрыва элементов воды (н

и ОН-группа) может происходить в различных позициях. Соответственно этому

конечными продуктами гидролиза крахмала оказываются либо глюкоза, либо мальтоза, либо олигосахариды. Естественно, что в процессе постепенного укороче­

ния молекулы крахмала в результате гидролитического отщепления моносахарид­

ных, дисахаридных или олигосахаридных звеньев на какой-то ступени распада

в качестве промежуточных продуктов возникают декстрины. Наличие и динамику их образования легко установить, прослеживая изменение окраски крахмала с ио­

дом от синей до красно-бурой в процессе ферментативного гидролиза крахмала.

В природе найдено несколько различных амилаз.

Dпoкоамилаза, или 'У-амилаза (а-l,4-глюкан глюкогидролаза), ускоряет реак­

цию гидролиза 1,4-связей в молекуле крахмала, олигосахаридов и даже дисахари­

дов (например, мальтозы), последовательно отщепляя остатки глюкозы от невос­

станавливающегося (не содержащего свободной альдегИдНОЙ группы или гликозид­ ного гидроксила) коIЩa молекулы. Механизм ее действия можно представить следующей схемой:

328

Цифрами 1,11, 111, lV и т. д. здесь обозначены последовательные реакции mдролиза 1,4-связей в молекуле l,4-глюкана при каталитическом воздействии глюкоамилазы. Если в молекуле полисахарида есть разветвление, то действие 'У-амилазы прекращается. Глюкоамилаза ускоряет mдролиз не только крах­

мала, но и гликогена.

Глюкоамилаза распространена повсемесmо; она открыта Е. Л. Розенфельд

(959) в тканях животных, где ярко представлена, как, впрочем, и в плесне­ вых грибах. Из ряда источников глюкоамилаза выделена в гомогенном состоя­ нии. Ее молекулярная масса в большинстве случаев близка к 100000 ('У-амилаза из почек человека-97000, из печени быка-l07000, из печеникрысы-114000,

из гриба асперmлла-всего 62000). Для глюкоамилазы из печени быка доказа­

на мулътимерная структура молекулыI: 4 субъединицы по 26000 каждая. Обнару­

жено 2 вида глюкоамилаз-кнслая (оптимум рН 4,8-5,0, локализована в лизо­

сомах, КМ дЛЯ гликогена-5,45 '10-3 М) и нейтральная (оптимум рН 6,0-6,5,

локализована в микросомальной фракции клетки и в mалоплазме, КМ дЛЯ

гликогена-16,25 '10-3 М). Отсутствие кислой глюкоамилазы у человека связа­

но с тяжелым наследственным заболеванием-гликогенозом; оно состоит в накоплении гликогена в клетках печени, мыIIЩ и.дрymх органов. Глюкоамила­ за иммобилизована и в этом виде применяется в промышленном масштабе для

гидролиза крахмала до глюкозы; созданная у нас установка позволяет вести

процесс в течение 3 месяцев без заметной потери активности фермента.

I3-Амнлаза (сх-l,4-глюкан мальтогидролаза) ускоряет реакцию гидролиза

крахмала по 1-4 связям,'последовательно отщепляя остатки мальтозы, начи­

ная с нередуцирующего конца молекулы крахмала; ее действие, как и 'У­

амилазы, прекращается в точках разветвления в молекуле крахмала:

0-

__________...J..~:.:...-__________tL+Н20~и.2.~

'-Амилаза

Мальтоза, освобождающаяся при mдролизе крахмала под действием 13-

амилазы, получается в l3-форме:

Предполагают, что образование l3-формы мальтозы, т. е. изменение про­

странственной конфигурации молекулы по месту образующегося гликозид­ ного гидроксила при l-м углеродном атоме остатка глюкозы, происходит в момент гидролиза сх-гликозидной связи. В соответствии с этим фермент

и получил свое название. I3-Амилаза характерна только ДЛЯ высших растений,

329