Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии

Глюкоза Высшие жирные :кислоты (ВЖК)

НАД+

НАДН + н+ НАД+

'----""'"

Окислительное фосфорилирование

Рис. 128. Локализация синтеза АТФ при субстратном и окислительном

фосфорилировании (пояснения в тексте)

такого сопряжения и механизм перевоса активированного фосфата на АДФ

детально рассмотрены выше (см. рис. 114). Однако посредством реакций

субстратного фосфорилирования образуется сравнительно небольшое количе­

ство АТФ (рис. 128).

Окислительиое фосфОРИJIИPовавие. lJIавваи масса АТФ у аэробных организ­

мов синтезируется путем окислительного фосфорилирования в митохондри­ ях-эmх поистине энергетических фабриках клетки.

Атомы водорода, снятые с субстратов в цикле ДИК8рбоновых и трикарбонО-:

вых кислот, при ~-окислении высших жирных кислот, при nируватдегидрогеназ­

ной, глутаматдегидрогеназной и некоторых других реакциях поступают в дыха­

тельную цепь ферментов внутренней мембраны митохондрий. Универсальным

донором атомов водорода для дыхательной цепи ферментов служит НАДИ.

Если при окислении субстрата возникает НАДФН, то осуществляется реакция

420

НАДФН+НАД+ ,НАД (Ф)-трапсгпдрогепа.а НАДФ+ +НАДН

Следовательно, и в этом случае атомы Н перед поqупленйем в дыхательную цепь передаются на НАД + (рис. 128).

Другим первичным источнико.м атомов водорода и электронов в дыхатель­ ной цепи служит восстановленный флавопротеин, если он выполняет роль первичной дегидрогеназы, как, например, в случае окисления янтарной кисло­ ты в цикле трикарбоновых и дикарбоновых кислот (см. рис. 117). Флавопроте­ ин, но несколько иной природы, служит передаточной инстанцией для атомов водорода и электронов от НАДН к убихинонпротеину дыхательной цепи.

На рис. 129 представлена дыхательная цепь ферментов митохондриальной

мембраны. Естественно, что она открывается НАДН, с которого атомы

Н передаются на первый белковый компонент дыхательной цепи-флаво­

протеин, несущий флавинмононуклеотид (ФМН) в качестве кофермента.

Остальные компоненты дыхательной цепи располагаются в порядке возраста­

ния их нормальных (измерены при 1 М концентрации и температуре 250 С, что обозначают индексом Ео и рН 7,0 и маркируют значком ') окислительно­

восстановительных потенциалов (БЫ, обеспечивающих упорядоченную пе­

редачу атомов водорода и электронов по такой редоксцепи.

Самой примечательной особенностью дыхательной цепи ферментов явля­

ется наличие в ней участков, где соседние компоненты резко' отличаются

значениями окислительно-восстановительных потенциалов (АЕо):

Нормальные окнслител"но-восстаиовнтельные потенциалы соедииеиий,

участвующих в биологнческом окислении

422

Именно здесь происходит сопряжение окисления с фосфорилированием АДФ

(рис. 129), так как разность энергетических уровней электрона, транспортиру­

емого с огромной скоростью (около 1 мс от одного переносчика к другому), вполне достаточна для синтеза макроэргической связи и составляет 51 кДж

для 1, 36-для Ilи 80,7 кДж для IlIточки сопряжения. В целом интенсивность

окислительного фосфорилирования определяется энергеmческим зарядом, т. е. соотношением моно-, ди- и трифосфатов аденозина:

Цепи дыхательных ферментов

Б

Рис. 130. Структура митохондрии (А) и схема расположени. ферментов ДllIXa­ тельной цепи и АТФ-синтаэного комплекса в ее внутренней мембране (G):

ФМН-флавопротеин с ФлаВRНМОНОНУJCлеотидом в JCачecrве II:0фермента; Fes-.елезоссрllыe 1ic:JooI;

Q-убнхинонпротенв; Ь, с и с-uитохромы; а'" -ЦИТОХРОМОII:сндаза

423

Межмембранное

пространство

Рис. 131. Трансмембранный перенос электронов и протонов и сопряжение его с синтезом АТФ (обозначения те же, что на рис. 129)

Мембраны, несущие ферменты переноса электронов и сопряженного с ним фосфорилирования, называются сопрягающими. К ним относятся: внутренняя

мембрана митохоНДРий, мембрана тилакоидов хлоропластов зеленых расте­ ний, мембрана хроматофоров фотосинтезирующих бактерий и клеточные мембраны аэробных бактерий, обладающих дыхательным типом энергетики.

Они характеризуются толщиной в 7,0-9,0 им, преобладанием белков над

липидами (2: 1), низким содержанием холестерола и наличием кардиоmшина; примерно третья часть входящих в их состав белков принадлежит ферментам

дыхательной цеilИ, собранным в ансамбли (рис. 129),- в каждой митохондрии

клеток печени крысы, например, их содержится несколько тысяч.

Наиболее полно изучены структура и функция сопрягающей мембраны

митохондрий. Наряду с дыхательным ансамблем ферментов в ней находится

АТФ-синтазный комплекс, ответственный за образование АТФ. Каким же образом расположены они в митохоидрии? Ответ на этот вопрос дает рио; 130. И тот и другой феРМ(tнтные комплексы локализованы во внутренней мембране митохондрий (рис. 130, Б), причем АТФ-синтазный комплекс представлен так

называемыми грибовидными выростами, которые усеивают внутреннюю ме­ мбрану и обращены в сторону матрикса митохондриальных частиц.

Проблема сопряжения окисления с фосфорилированием необыкновенно

сложна и далека еще от окончательного разрешения. Ранние гипотезы по

этому вопросу: гипотеза химических переносчиков (Е. Слейтер, 1953) и кон­ формационная гипотеза (п. Бойер, 1964) представляют в настоящее время

лишь исторический интерес, хотя отдельные элементы той и другой в некото­

рой мере присутствуют в общепризнанной сейчас хемиосмотической rипотезе п. Митчела, поддержанной и развитой в нашей стране благодаря трудам В. п. Скулачева и сотр.

Согласно хемиосмотической гипотезе, именно структурные и фушщио­

нальные особенности сопрягающей мембраны (этот термин введен в био­

энергетику В. п. Скулачевым) обеспечивает биосинтез АТФ. В процессе

функционирования дыхательной цепи ферментов в сопрягающей мембране

митохондрий, не проницаемой ни дЛЯ НАДН, ни для протонов, происходит

активный перенос шести Н+ из матрикса в межмембранное пространство (рис. 131) на каждую пару электронов, проходящих по электронотранспорmой цепи. По поводу механизма этого переноса высказаны разные мнения. Сущ­

ность некоторых из них ясна из рассмотрения рис. 131. Предполагают также, что перенос протонов идет при участии протонных траислоказ-специфи­ ческих белков, локализованных в сопрягающей мембране и обеспечивающих

424

Рис. 132. Протонная помпа, сопряженная с цитохром с-оксидазой митохо-

ндриальной мембраны

При М=I40000 цитохром ,,"ОКСИдаза состоит из 7 субъедиииц, содержаЩIIJI. 2 атома cu и 2 атома

Fe (В составе пма, показаи овальиым кружком), соедивевных КООРдинациоиными СВ!l3I1М11 С атома­ ми азота РaдlПaJIОВ zиc. Так ках атомы Cu и Fe цитохрома а· Dз НВХОДВТС!: на расстОJIВRИ 3,5 ВМ. ТО

возможен ТОЛЫС:О тоннельный переRОС электронов ме:к.ду ними. ЦитОIРОМО.сидазв. измени I:ОВ­ формацию при переносе электронов, либо сама ВЫПОЛИllет фуипппо протонной помпы, либо дла этого служит тесно прилегающий " иеli белОК. Как ВИДНО из рисунка, мехаиизм UТИВИРОВ8ИИа

молежулирного кислорода цитохромок.сидазой вполне аналогичен таховому у ДИОl:сигепаз и не:к:ото-

рых МОИОOl:сигенаэ. т. с. осущестВJlJlетса за счет передачи на кислород ЭJlCk1pонов С Fe' + н Cu+•

перенос протонов сопряженно с транспортом электронов при помоuци бел­ кового комплекса, как, например, в случае цитохромоксидазы (рис. 132) или

НАДН: Q-оксидоредуктазы.

Врезультате создается трансмембранная разность потенциалов, так как

св-нешней стороны внутренней мембраны митохондрий, в межмембранном

пространстве, накапливаются Н+, а на внутренней ее стороне, в матриксе,­

он- (см. рис. 131). Возникает градиент электрохимического потенциала н+

(его обозначают как L\Jlи+). Он складывается из градиента электрического

потенциала-L\ф и градиента концентрации водородных ионов-L\рН и явля­ ется движущей силой синтеза АТФ.

Естественно, что ионы Н, накопившиеся в межмембранном пространстве

митохондрии, перенесенные туда за счет потерянной электронами энергии

в процессе их транспорта по дыхательной цепи ферментов и перехода с более высокого энергетического уровня в окисляемом субстрате на более низкий

энергетический уровень в активированной молекуле кислорода (см. рис. 129),

стремятся вернуться в митохондриальный матрикс. Энергезированная, электриче­

ски заряженная внутренняя мембрана митохондрий способна деэнергезироваться,

разрядиться. Этот процесс осуществляется при помощи протонной АТФазы.

Протонная АТФаза (Н+-АТФаза)-липопротеиновый комплекс. mдроли­

зующий АТФ сопряженно странсмембранным переносом водородпых ионов против их электрохимического градиента (L\Jlи+). Энергия для такого переноса

Н+ против градиента их концентрации черпается за счет энерrии распада­

ющейся макроэргической связи в молекуле АТФ при ее гидролизе. В условиях

нарушения целостности комплекса FoF1 (рис. 132) митохондрий, Н+-АТФаза ускоряет именно этот процесс, обеспечивая обратный транспорт Н+ и со­

здание L\Jlи+. Но в составе энергезированной митохондриальной мембраны, при нормальном состоянии комплекса F о . F1, функция протонной АТФазы

425

А

Матрикс

Липидный

бислой

СОПРllгающей мембраны

Me"'MeMllpaHHoe

пространство

АДФ. + .Рн

,.8:<11. , . -- _

--_.tJi. IJJ.!U·_--

!~

f+

Рис. 133. Строение протонной АТФазы (пояснение в тексте)

сводится не к переносу ионов водорода из матрикса в межмембранное про­ странство, а, наоборот, к транспорту протонов внутрь митохоНДРии, К СНЯ1ИЮ

электрохимического градиента Н и, само собой разумеется, к синтезу (сопря­

женно с переносом н+ с внешней стороны сопрягающей мембраны на ее

внутреннюю сторону) АТФ. Поэтому ее называют также АТФ-синтазой, что подчеркивает ее истинную функцию в митохондриальной мембране.

АТФ-синтаза (протонная (АТФаза) представлена двумя беЛkОВЫМИ КОМ­ плексами, состоящими, в свою очередь, из субъединиц (рис. 133, А). Первый из

НИХ, полностью «утопленный» в сопрягающую мембрану и пронизывающий ее

насквозь, состоит из трех видов mдрофобных полипептидных цепей (с раз­

личающимися в зависимости от объекта молекулярными массами порядка

19000-24000. 13500-18000 и 5400-8400 в соотношениях 1:2:5 или близких

к этому) и обозначается как Fo• Его функция состоит в доставке протонов из

межмембранного пространства, куда он открывается, ко второму белковому

комплексу, плотно к нему примыкающему.

Второй комплекс включает в свой состав пять различных белков и выступа­

ет, будучи частично погруженным, из сопрягающей мембраны в виде грибо-

426

видного выступа. Это F1-фактор или сопрягающий фактор, непосредствеmю ответственный за биосинтез АТФ. Его молекулярная масса, слегка варьирую­ щая в зависимости от объекта выделения, составляет в среднем 368000, а субъединицы представлены полипептидами с М-57 000 (сх), 53 000 (fЗ), 34000 (у)' 17000 (о) и 10000 (Е). ПО данным ряда авторов, субъединичный состав

сопрягающего фактора подчиняется формуле СХзJ3зуо&. Полагают, что катали­ тический центр, ускоряющий реакцию синтеза АТФ из АДФ и НзРО4, нахо­

дится на J3-субъединице, а сх-субъединица прикрывает его от воздействия ингредиентов митохондриального матрикса. Есть также мнение, что Е-субъ­

единица регулирует деятельность протонной АТФазы, ингибируя ее способ­

ность гидролизовать АТФ. Аналогично построены и действуют хлоропласmая

и бактериальная Н+-АТФазы.

Каким же образом возникает АТФ при посредстве АТФ-синтазы? На этот

вопрос еще нет исчерпывающего ответа, но предложено несколько заслужива­

ющих внимания концепций.

Первая из них сводится к предположению, что протоны, поступающие по

протонпроводящему каналу Fo, активируют иеорганический фосфат (Рн), связан­

ный активным центром J3-субъединицы, отнимая от него ОН-группу (реакция

элиминирования воды). Одновременно ОН-группа концевого фосфата АДФ, также присоединенного к активному центру J3-субъединицы, теряет протон за счет взаимодействия с ОН--группой матрикса (где ОН--группы накапливают­

ся в результате переноса Н+ в межмембранное пространство, см. рис. 131). Активированные фосфат и АДФ соединяются и образуют АТФ (рис. 133, Б, 1).

Вторая концепция состоит в допущении, что ионы Н в активном центре

сопрягающего фактора активируют фосфат и карбоксильную группу одной из

субъединиц F1-фактора, в результате чего возникает фосфоэнзим, где фосфат присоединен макроэргической связью. При последующем взаимодействии

АДФ и фосфоэнзима образуется АТФ (рис. 133, Б, 2). Здесь в видоизмененном

состоянии представлена гипотеза переносчиков.

Третья концепция исходит из предположения, что роль транслоцируемых

8 F1-фактор протонов состоит в изменеиии конформации F1-фактора. Обладая не менее чем двумя центрами связывания АДФ и неорганического фосфата,

F.-фактор способен синтезировать АТФ из АДФ и Рв, если связывающий

центр находится в закрытом состоянии. При этом АДФ и РИ В нем находятся в окружении аминокислотных радикалов, способствующих отнятию молекулы

воды и синтезу АТФ (рис. 133, Б, 3, правая сторона F1-фактора). При трансло­

кации протонов центр связывания открывается, и АТФ из него поступает

в матрикс (левая сторона F1-фактора на рис. 133, Б,3), а ее место занимают

АДФ и Рн• Новый цикл конформационных перестроек переводит этот центр связывания в закрытое состояние с одновременным высвобождением готовой АТФ из другого связывающего центра, переходящего в открытое состояние.

Легко заметить, что в этом объяснении механизма биосинтеза АТФ использо­

ваны идеи конформациопной гипотезы сопряжения окисления с форфорилиро­

ванием.

В последнее время появились новые точки зрения на механизм АТФ­

синтазной реакции. А. Д. Виноградов предложил кинетическую модель, в соответствии с которой синтез АТФ в АТФазном комплексе и гидролиз АТФ F1-АТФазой идут разными путями и каталитически ускоряются раз­ ными формами фермента, причем синтазные центры локализованьi на сх-субъединице, а гидролазные-на J3-субъединице. Л. Ф. Дмитриев обосно­

вал вариаит химнческой гнпотезы, где роль интермедианта играет энергизи­ рованны й липидный радикал сопрягающей мембраны и учитывается роль электрохимического потенциала и внутримембранных протонов в процессе

427

переноса электронов в дыхательной цепи ферментов, для синтеза пирофосфата

и полифосфатов (как макроэргических соединений).

Источником энергезированного состояния мембраны может быть также

возникновение электрохимического потенциала .6J.1Na+, что характерно для

некоторых морскцх бактерий. У них .6J.1Na+ используется для приведения

в движение жгутиков, создания солевых градиентов и, что самое важное, для

синтеза АТФ при посредстве Na+-зависимой АТФазы (Na + -АТФ-синтазы).

В связи с этим возникает вопрос о статусе других металлозависимых АТФаз

(Na +, к+-АТФазы, Са 2 +-АТФазы) и не исключено, что эта область исследова­

ний станет в перспективе «горячей точкой» биоэнергетики.

Сказанное, по мнению В. п. Скулачева, наводит на мысль о том, что

возникновение .6J.1H+, а в ряде случаев .6J.1Na+· на сопрягающей мембране есть универсальный способ запасения энергии в клетке, предшествовавший ее кон­

сервированию в макроэргических связях АТФ.

Более того, современные наблюдения говорят о том, что в клетках, например

мышечных, существует митохондриальный ретикулум, при помощи которого

митохондрии связаны в единую цепь или представляют собой одну гигантскую

разветвленную мвтоховдрию. По ее энергезированной мембране .6 J.1 н+ может

передаваться на значительные расстояния для того, чтобы в нужном месте

обеспечить синтез необходимого количества АТФ или выполнить иные функции, присущие мембранному электрохимическому потенциалу (рис. 134).

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ БАЛАНС РАСПАДА YrnEBQЦOB

И ТРИГЛIЩЕРИДОВ

Если суммировать уравнения реакций, которые осуществляются при бро­

жении, гликолизе или полном окислении глюкозы по апотомическому или

дихотомическому пути, то легко прийти к следующим результатам.

428

Неполное окисление

Брожение

СБН12О6+ 2НЗРО4+ 2АДФ-+2С2НsОН+ 2СО2+ 2АТФ+ 2Н2О

Гликолиз

Полное окисление

Аnотомический путь

С6Н1206+АТФ+7Н20+12НАДФ+-+6СО2+АДФ+НзРО4+

+ 12НАДФН+ 12Н+

Дихотомический путь

С6Н12О6+4НЗРО4+4АДФ+ 10НАД+ +2ФАД+2Н2О­

-+ 6СО2+ lОНАДН+ 10Н+ + 2ФАДН2+4АТФ

Если принять, что все атомы водорода, снятые с субстратов при полном окислении, будут направлены в дыхательную цепь ферментов и их дальнейшая передача на кислород пройдет сопряженно с фосфорилированием, то в каждом случае должно образоваться определенное, но разное число молекул АТФ. Размеры синтеза АТФ, или, что то же самое, энергетический эффект распада

углеводов, выразятся для каждого пути ра.спада следующим образом:

Таким образом, для организма наиболее выгоден В'энергетическом смысле

обмен углеводов, идущий по пути дыхания,-он являе1СЯ источником мак­

симального числа молекул АТФ, запасаемых в организме. В этом случае

наlfЛУЧШИМ образом консервируется энергия. Брожение и гликолиз дают ничтожное количество АТФ и могут лишь кратковременно или в особых

условиях заменять окислительный распад углеводов.

Если сопоставить изменение уровней свободной энергии при брожении, гликолизе и дыхании с количеством энергии, запасенной в макроэргических связях АТФ в этих же случаях, то оказывается, что при спиртовом брожении запасае1СЯ

27,8%, при гликолизе- 32,8, при полном окислении по апотомическому пути- 39,6,- а по дИхотомическому пути-43,О% энергии, способной вьщелиться при

сгорании глюкозы. Таким образом, не только общий уровень запасаемой энергии, но также и доля ее от общего количества высвобождаемой энергии оказывается максимальной в случае полного распада глюкозы по дихотомическому пути.

Каков же энергетический эффект окисления другого класса органических

соединений-триглицеридов, окислительный распад которых сопряжен с фос­ форилированием? Проведем соответствующие расчеты для реа1ЩИИ окисления

тристеарина.

Врезультате гидролиза тристеарина получается ,одна молекула глицерина

итри молекулы стеариновой кислоты. При окислении глицерина дО СО2

429