9.) Хромосомные карты.  Цитогенетическая карта  Физическая карта  Рестрикционная карта

Физические карты генома отражают реальное расстояние между маркерами, выражаемое в парах оснований. Физические карты различаются по степени их разрешения, т.е. по тем деталям структуры генома, которые на них представлены (рис. II.39). Исчерпывающая физическая карта генома человека максимального разрешения будет содержать полную нуклеотидную последовательность всех его хромосом. На другом полюсе физических карт с минимальным разрешением находятся хромосомные (цитогенетические) карты генома.

Рис. II.39. Четыре типа генетических карт геномной ДНК и их взаимоотношения

1 – генетическая карта сцепления, 2 – физическая рестрикционная карта, пробелы обозначают места расщепления ДНК рестриктазами, 3 – физическая карта контигов, показаны перекрывающиеся клоны ДНК, полученные с помощью YAC-векторов, 4 – исчерпывающая физическая карта в виде последовательности нуклеотидов ДНК. На всех картах представлен один и тот же участок хромосомы

Хромосомные карты. Хромосомные карты генома человека получают локализацией генетических маркеров на индивидуальных хромосомах с использованием цитогенетических методов, включая авторадиографию и FISH. В последних двух случаях радиоактивная или флуоресцентная метки, ассоциированные с исследуемыми генетическими локусами интактных хромосом, выявляются с помощью световой микроскопии. Еще совсем недавно хромосомные карты позволяли локализовать исследуемый фрагмент ДНК на участке хромосомы протяженностью 10 м.п.о. Современные методы гибридизации in situ с использованием метафазных хромосом, главным образом, метод FISH, локализуют полинуклеотидные маркеры в пределах 2–5 м.п.о. Более того, при гибридизации in situ с интерфазными хромосомами, в которых генетический материал находится в менее компактной форме, разрешающая способность хромосомных карт приближается к 100 т.п.о.

Точность хромосомных карт повышается и с использованием современных генетических методов. Например, способность ПЦР амплифицировать сегменты ДНК единичного сперматозоида позволяет исследовать большое число мейозов, как бы законсервированных в отдельных образцах спермы. В результате появляется возможность проверки взаимного расположения генетических маркеров, локализованных на хромосомных картах более грубыми методами.

Карты кДНК. Карты кДНК отражают положение экспрессирующихся участков ДНК (экзонов) относительно известных цитогенетических маркеров (бэндов) на метафазных хромосомах. Поскольку такие карты дают представление о локализации транскрибирующихся участков генома, в том числе и генов с неизвестными функциями, они могут быть использованы для поиска новых генов. Этот подход особенно полезен при поиске генов, повреждения которых вызывают заболевания человека, в том случае если приблизительная локализация таких участков хромосом уже предварительно проведена на генетических картах сцепления в результате семейного генетического анализа.

Рестрикционная карта (restriction map): линейное изображение последовательности ДНК , которое показывает расположение сайтов узнавания специфических рестрикционных ферментов. Рестрикционные карты строят при исследовании протяженных (до 40 т.п.о.) клонированных последовательностей нуклеотидов, включающих исследуемые гены, . Рестрикционные карты представляют собой схемы, изображающие взаимное расположение сайтов рестрикции для разных рестриктаз и расстояния между ними. Поскольку каждый сайт рестрикции является не чем иным, как строго определенной последовательностью нуклеотидов ДНК, рестрикционные карты заключают в себе информацию об особенностях первичной структуры картируемых участков генома.

Для построения рестрикционной карты используют гибридизацию по методу Е. Саузерна. Клонированный фрагмент ДНК отдельно или в составе вектора получают в препаративном количестве, затем его обрабатывают соответствующими рестриктазами и продукты рестрикции разделяют электрофорезом в агарозном геле. Количество образовавшихся рестрикционных фрагментов ДНК, обнаруживаемых после окрашивания бромистым этидием в виде флуоресцирующих полос в ультрафиолетовом свете, соответствует количеству сайтов рестрикции в том случае, если различия в размерах образовавшихся фрагментов ДНК достаточны для их разделения при электрофорезе.

10.) Формулы кариотипов аутосомных анеуплоидий: синдром. Дауна, синдром. Патау, синдром Эдварса, транслокационных форм с. Дауна, с. Патау, синдромы хромосомных делеций: «кошачьего крика», Вольфа – Хиршхорна.

1. Синдром Вольфа – Хиршхорна – частичная моносомия - делеция (утрата части генетического материала) короткого плеча 4 хромосомы

Формула синдрома Вольфа – Хиршхорна 46,ХХ, 4 p– , утрата сегмента p 16

2. Синдром «крика кошки» - частичная моносомия делеция короткого плеча 5 хромосомы, формула синдрома: 46,ХХ, 5p–, утрата сегмента p 15

3. Филадельфийская хромосома Ph – делеция 21 хромосомы, впервые описана в Филадельфии. Она выявляется только в клетках кроветворной системы - костного мозга, гранулоцитах. Мутантная клетка вытесняет нормальные кроветворные. У носителей этой мутации развивается хронический миелолейкоз. При синдроме Дауна острый лейкоз возникает в 10 – 20 раз чаще, чем среди общей популяции.

4. Транслокационные центрические робертсоновские - rob формы:

синдрома ДАУНА – 46,ХХ, t 21/21; 46,ХУ, t 21/15, ( чаще на 15, реже 14, еще реже на 21, 22 и У хромосомы); синдрома ПАТАУ – 46, t 13/13, ХХ; 46,t 13/15,ХУ.

11.) Половой хроматин. Изучение полового хроматина, как экспресс метода в медицине для скрининга (просеивания) хромосомных синдромов в диагностике геномных и хромосомных мутаций при их разделения на аутосомные и гоносомные. В 1949 г. Барр и Бертрам в ядрах нейронов самок кошек обнаружили интенсивно, окрашенную глыбку хроматина. Она имеет треугольную форму и прилежит к внутренней мембране ядра. Далее было установлено, что только одна из двух Х-хромосом в соматических клетках женских особей функционально активна, другая конденсируется (факультативный гетерохроматин), и в интерфазном ядре образует Х-хроматин, или тельце Барра. Этот процесс имеет случайный характер в эмбриональном периоде. В норме у женщин (46, ХХ)– одно тельце Барра, у мужчин (46, ХУ) оно отсутствует. Изменение числа Х-хромосом ведёт к изменению числа телец Барра.

Количество телец Барра всегда на единицу меньше, чем количество половых Х-хромосом в кариотипе. Сумма п Х – 1.

Этот феномен получил название правила СТЮАРТА. Например, если кариотип 47, ХХХ, то три Х-хромосом минус одна, равняется два тельца Барра. Присутствие полового хроматина у мужчин, а также наличие дополнительных или отсутствие телец Барра у женщин характерно для нарушений в системе половых хромосом.

Увеличение числа У-хромосм приводит к увеличению флуоресцирующих телец в интерфазных ядрах, названных У-хроматином.

Разработан экспресс-метод определения полового хроматина в соскобе буккального эпителия слизистой щеки. Материал соскоба, полученный с помощью шпателя, переносится на предметное стекло и окрашивается 1% -ным раствором ацетоарсеина, накрывается покровным стеклом и изучается с помощью светового микроскопа.

Используют определение полового хроматина для:

• Своевременное определение пола в решении вопросов, о наследственных сцепленных с полом заболеваний,

• Экспресс-диагностики хромосомных болезней, связанных с нарушением комплекса половых хромосом это с. Клайнфельтера 47, ХХУ. 48, ХХХУ,

Тернера 45, ХО,

Морриса 46, ХУ – женский фенотип,

Трипло – Х – суперженщина 47, ХХХ,

Дисомию по У-хромосоме 47, ХХУ.

+ Возможность выявить мозаицизм по половым хромосомам – гинандроморфизм – ХХУ/ХХ проявляются как, женские так и мужские признаки. Описаны самые разнообразные формы кариотипов ХУ/ХО, ХХ/ХО, ХХХ/ХО,ХХ/ХХХ, тройные мозаики ХО/ХХ/ХХХ.

• Определение пола в судебной медицине

• В онкологии для определения опухоли по половому хроматину и выбора правильного гормонального лечения

12.) Формулы кариотипов гоносомных анеуплоидий: с. Тернера, с. Клайнфельтера, с. Трипло Х. синдром Тернера – 45,ХО, (девочка) полная моносомия, существует несколько цитогенетических вариантов, в том числе мозаичных форм

синдром трипло – «Х» – 47, ХХХ (девочка) полная трисомия

синдром Клайнфельтера – 47, ХХУ, (мальчик), существует несколько цитогенетических вариантов синдром дисомии по «У» хромосоме 47, ХУУ (мальчик).