Подбор клеточного материала. Культивирование

У человека в большинстве случаев используют препараты из клеток костного мозга, кратковременной культуры крови или из длительной культуры фибробластов кожи. Используют биоптаты семенников, слущенные эмбриональные клетки плода (аминиоцентез), плацетобиопсия (биопсия плода – хорионбиопсия и плаценты).

Наиболее простым и доступным методом является культивирование клеток крови. Пункция костного мозга или биопсия кожи для культивирования фибробластов технически сложнее, и к тому же аспирация костного мозга – весьма неприятная процедура. Препараты из костного мозга имеют, однако, то преимущество, что дают возможность изучать митозы in vivo, вне культуры клеток, а сразу после взятия материала у пациента.

В крови здоровых людей нет делящихся клеток. Однако митоз этих клеток можно стимулировать искусственно, обработав их стимулятором митоза фитогемагглютинином ФГА.

1. Берут один миллилитр периферической крови.

2. Суспензию лейкоцитов выращивают в культуральной среде in vitro 72 часа и затем готовят препараты хромосом.

3. Чтобы остановить клетки в прометафазе, подавляют образование веретена деления веществами с колхицином.

4. Для свободного распределения хромосом в плоскости препарата клетки обрабатывают гипотоническим раствором.

5. Затем каплю суспензии наносят на стекло и окрашивают.

Окрашивание.

Наиболее простой способ окрашивания – простая рутинная сплошная по всей длине хромосомы основным (щелочным) красителем Гимза или 2% - ным ацетоорсеином или ацеткармином. Эти красители окрашивают хромосомы целиком, равномерно и интенсивно. Для выявления численных аномалий хромосом этот метод вполне достаточен.

Для получения более детальной картины структуры хромосом или их сегментов используют различные способы дифференциального окрашивания.

Методы дифференциальной окраски хромосом основаны на действии солевых растворов с определённым Ph, температурным режимом, обработкой ферментами протеазами. Этими методами установлена четкая структурная разнородность хромосом по длине на красящиеся (тёмные - гетерохроматин) и некрасящиеся (светлые - эухроматин) полосы.

Дифференциальное окрашивание приводит к появлению линейного рисунка по длине хромосомы. Рисунок этих полос специфичен, индивидуален для каждой пары хромосом. Рисунок сегментации зависит от особенностей неоднородности целостного комплекса ДНК–белок в разных участках по длине хромосом.

Различные типы сегментов обозначают по методам, с помощью которых они выявляются наиболее отчетливо.

Способы дифференциального окрашивания: q, g, r, c, t - окрашивание.

а) Q – сегменты (quinacrine, акрихин) – участки хромосом способных связывать флюорохромы, флюоресцирующие (яркое свечение) после окрашивания акрихин – ипритом. Q – сегменты соответствуют участкам богатым АТ парам (55 – 65%) ДНК и содержат тканеспецифические гены, реплицирующиеся во второй половине S – периода интерфазы. Преимущество Q метода состоит в том, что позволяет даже в интерфазном ядре идентифицировать «У» хромосому человека по яркой флуоресценции в виде парных светящихся точек. Для просмотра таких препаратов используют люминесцентный микроскоп.

б) G – сегменты (Gitmsa, Гимза) выявляются при окрашивании красителем Гимза в сочетании с дополнительными протеолитическими процедурами, которые способствуют тому, что краситель адсорбируется наиболее интенсивно на определённых G – сегментах (образуя тёмные диски - гетерохроматиновые участки и светлые - эухроматиновые). Этот метод чаще используют в повседневной работе большинства лабораторий, поскольку он не требует использование флуоресцентного микроскопа. Q и G сегменты совпадают. К разновидностям окрашивания по методу Гимзы относятся R и С – окрашиваемость

в) R – сегменты (reverse, обратные) окрашиваются после тепловой денатурации и располагаются между Q и G сегментами. Окрашенные и неокрашенные сегменты располагаются обратно тому, что наблюдается при G и Q – окрашивании. R – сегменты, соответствуют участкам богатым ГЦ – парам (50 – 60%) ДНК, которые более устойчивы к тепловой денатурации. Они содержат общеклеточные гены, реплицирующиеся в первой половине S – периода интерфазы (на G и Q окрашенных

хромосомах это светлые – эухроматиновые участки). На R – окрашенных хромосомах это тёмные эухроматиновые. Гетерохроматиновые и околоцентромерные районы остаются светлыми

Схематичное изображение дифференциальной G и R окраски хромосом кариотипа человека

G R

г) С– сегменты (constituve heterochromatin, конститутивный гетерохроматин) окрашивают прицентромерные районы хромосом, более устойчивые к химическим и физическим повреждениям. В этих участках ДНК с многократно повторяющимися последовательностями. С – окрашивание позволяет выявить сегменты центромерных участков коротких плеч 13, 14, 15, 21, 22, и У хромосом. Это окрашивание выявляет, структурный, или конститутивный гетерохроматин.

д) Т – сегменты, окрашивание теломерных концевых зон хромосом.

Достижения молекулярной цитогенетики позволили внедрить в клиническую цитогенетику новых технологий, таких как ДНК диагностика, гибридизация нуклеиновых кислот на препарате in siti, а также компьютерных систем для анализа хромосом. ДНК диагностика основана на использовании технологии рекомбинантных молекул ДНК для выявления молекулярно генетического дефекта хромосом.