Клиническая биохимия / Кленова Н.А. Биохимия патологических состояний

оксидазная активность церулоплазмина проявляется in vivo. Изучена активность (при добавлении искусственного субстрата) при некоторых заболеваниях. Снижение наблюдается при нарушениях обмена меди (гепатолентикулярная дегенерация), нефротическом синдроме. Низкие уровни (норма) характерны для новорожденных. Повышение – поздние сроки беременности (норма), цирроз, инфаркт миокарда [32]. Супероксиддисмутаза недавно выделена из плазмы крови человека в чистом виде [13]. Обнаружить активность в плазме крови непросто: существует в неактивной форме, в виде профермента. Активность регулируется специфической протеазой с помощью ограниченного протеолиза. Активация, вероятно, связана с определенным состоянием антиоксидантной системы крови, например, снижением содержания низкомолекулярных антиоксидантов в плазме. Псевдоацетилхолинэстераза (К.Ф. 3.1.1.8) проявляет меньшую специфичность по отношению к ацетилхолину по сравнению с истинной ацетилхолинэстеразой (мембраносвязанной). Катализирует расщепление не только ацетилхолина, но и других эфиров уксусной кислоты и холина с другими кислотами. Роль фермента в плазме до конца не выяснена. Наибольшие изменения зафиксированы при заболеваниях печени, так как здесь осуществляется синтез фермента. Снижение содержания связано с поражением паренхимы печени (цирроз), при механической желтухе – норма. Это служит диагностическим тестом для дифференциации этиологии желтух.

Ферменты, поступающие в плазму крови. В основном обнаружение активности (то есть содержания) большинства этих ферментов уже является патологией, так как они поступают в плазму при повреждении клеток и тканей. Рассмотрим ряд наиболее диагностически важных ферментов, проявляющих свою активность при развитии патологических процессов в организме человека.

А. Дегидрогеназы

Алкогольдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.1) – НАДН-зависимая оксидо-

редуктаза, содержащая цинк в составе молекулы. Катализируемая реакция:

СН3СН2ОН + НАД+ ↔ СН3СОН + НАДН + Н+

п-бутиральдегид, бензальдегид, формальдегид, ретиналь. Ингибируется конкурентно оксалоацетатом, неконкурентно – цианидом и солями тяжелых металлов. Имеет несколько конформационных вариантов – конформеров и около 9 изоферментных форм. Локализован в гепатоцитах (в основном),

61

появление в плазме свидетельствует о повреждениях и нарушениях функций гепатоцитов. Резкое повышение – острые гепатиты, при циррозах – норма. При гепатитах исчезает из плазмы быстрее, чем аминотрансферазы. Существуют индивидуальные колебания активности фермента, связанные с индуцибельностью (увеличением скорости синтеза под действием этанола). Активность определяется с использованием теста Варбурга (увеличение оптической плотности на длине волны 340 нм при переходе НАД+ из окисленного в восстановленное состояние). Если в качестве субстрата используется этанол, оптимум рН составляет 9,6.

Лактатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.27) – цитозольный НАДН-зависимый фермент многих клеток, также цинксодержащий. Катализирует реакцию обратимого превращения пировиноградной кислоты в молочную. Кроме пировиноградной кислоты, может восстанавливать α-кетобутират. Отличается гетерогенностью, то есть имеет множество изоферментных форм. Хорошо изучены пять изоферментов, но найдены также атипичные формы и шестой изофермент. Фермент состоит из четырех субъединиц. Различают Н, М и Х-субъединицы (табл. 1.3).

Таблица 1.3

Изоферментные формы лактатдегидрогеназы [28,35]

Атипичные формы ЛДГ представляют собой разнообразное сочетание субъединиц, отличающихся от указанных выше, и встречается у больных со злокачественными новообразованиями.

Диагностическая значимость определения активности в плазме невелика, так как фермент встречается во многих клетках и его происхождение трудно установить. Однако локализация 90% ЛДГ1 в кардиомиоцитах, ЛДГ5 – в гепатоцитах дает возможность использовать определение этих изоформ в диагностических целях. Значительное повышение активности ЛДГ1 обнаруживается на вторые сутки после инфаркта миокарда и держится в течение 5-6 дней. Тест имеет прогностическое значение. Чем выше активность в начале заболевания, тем неблагоприятнее прогноз. Увеличение активности ЛДГ5 обнаруживается в случае вирусного гепатита, при циррозах и механической желтухе – норма. Общая активность ЛДГ увели-

62

чена в плазме при злокачественных заболеваниях и других болезнях, связанных с нарушением целостности клеток.

Для определения активности используется тест Варбурга. Так как ЛДГ1 обладает наибольшим сродством к молочной кислоте, то для определения именно этого изофермента используют прямую реакцию и рН 8,0- 8,5, а для определения ЛДГ5 (высокое сродство к пирувату) и общей ЛДГ – обратную и рН 7,2-7,4.

Малатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.37). Широко распространенный фермент, катализирующий обратимую реакцию превращения малата в оксалоацетат. Есть НАДН и НАДФН-зависимые формы малатдегидрогеназы. Различают митохондриальные и цитозольные изоферменты. Ферменты встречаются в большом количестве в кардиомиоцитах, миоцитах, гепатоцитах, нефроцитах. Оптимум рН достаточно широк и располагается в пределах 7,4- 8,1. В присутствии НАДН малатдегидрогеназа (МДГ) может окислять, кроме малата, другие гидрокарбоновые кислоты. Митохондриальный изофермент обладает наибольшим сродством к малату, тогда как цитозольный – к оксалоацетату. В клетках встречаются и НАДФН-зависимые МДГ, в плазме обнаруживается только НАДН-зависимая форма.

Для определения активности используется тест Варбурга, однако возникают проблемы. Равновесие in vitro сдвинуто в сторону образования малата и реакция ингибируется избытком оксалоацетата. Оксалоацетат – соединение нестойкое и быстро разрушается до пировиноградной кислоты и СО2 химическим путем. Пировиноградная кислота может восстанавливаться имеющейся в плазме ЛДГ, и результаты оказываются завышенными.

Диагностическая ценность ввиду широкого распространения невелика, повышение активности в плазме регистрируется после инфаркта миокарда и при других заболеваниях, характеризующихся разрушением клеток. По причине присутствия малатдегидрогеназной активности в эритроцитах, при определении активности в плазме гемолиз недопустим. Появление в плазме крови митохондриального изофермента МДГ свидетельствует о тяжелых клеточных повреждениях: некрозах, апоптозной гибели клеток при распаде тканей.

Изоцитратдегидрогеназа (ИЦДГ) – фермент цикла трикарбоновых кислот. Катализирует обратимую реакцию превращения изоцитрата в α-кетоглутарат. В клетках встречаются НАДН- и НАДФН-зависимые формы. Для проявления активности требуется присутствие ионов Mn2+. НАДН-зависимая форма является митохондриальным изоферментом. НАДФН-форма широко распространена в тканях: печень, сердце, скелетная мускулатура. Ионы марганца могут быть заменены на Mg2+ и Ca2+. Фермент отличается значительной гетерогенностью. Открытие гетерогенности дало объяснение факту отсутствия активности ИЦДГ в плазме после инфаркта миокарда, хотя в кардиомиоцитах очень много этого фермента.

63

Изоферментная форма из кардиомиоцитов оказалась нестойкой и при попадании в плазму быстро теряет свою активность. При заболеваниях печени в плазме появляется активность ИЦДГ, так как гепатоцитарный изофермент стабилен.

Активность определяется по тесту Варбурга, оптимум рН 7,5, в качестве активатора используется соль Mn2+, субстратов – изоцитрат и НАДФ.

Клиническое значение: в основном диагностика заболеваний печени. Высокие значения активности в плазме – острый гепатит, повышенный уровень – хронические гепатиты.

6-фосфоглюконатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.44) – НАДФ-зависимый фермент пентозофосфатного окисления глюкозы. Катализирует окисление и декарбоксилирование 6-фосфоглюконата до рибулозо-5-фосфата.

Активируется ионами магния и марганца (двухвалентного), ингибирующее влияние оказывает Cu2+ и Hg2+. Широко распространен в клетках, есть генетически детерминированные формы, которые отличаются электрофоретически. В эритроцитах различают А, В и С формы.

Биохимическая активность в плазме не выявляется из-за отсутствия специфического для фермента микроокружения (фермент локализован в мембране). Добавление в инкубационную среду модификатора – цистеина – несколько увеличивает проявление каталитической активности в плазме. Оптимум рН 7,5; субстраты: 6-фосфоглюконат и НАДФ. Для определения активности используется тест Варбурга.

В клинике применяется в основном для выявления генетической недостаточности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в эритроцитах. Есть тесная корреляция между возрастом эритроцитарных клеток и активностью фермента (в молодых активность выше)[4]. В плазме повышение активности регистрируется при заболеваниях печени. Следует помнить, что фермент нестоек при нарушении мембраны, и определение активности нужно проводить в максимально короткие сроки после забора крови. Наличие гемолиза, даже небольшого абсолютно недопустимо.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. Первый и лимитирующий скорость пути фермент пентозофосфатного окисления глюкозы. Катализирует окисление глюкозо-6-фосфата до 6-фосфоглюколактона. НАДФ-зависимый олигомерный фермент, локализован в мембранах клеток. Легко диссоциирует на субъединицы при изменении микроокружения. Крайне нестоек при нарушении мембран. Активируется Mg2+, ингибируется Zn2+, Cu2+, Hg2+. Может использовать НАД в качестве кофермента (второго субстрата), но скорость окисления глюкозы намного ниже, чем при использовании НАДФ. Специфичен по отношению к субстрату, может окислять кроме глюкозо-6-фосфата галактозо-6-фосфат и 2-дезоксиглюкозо-6-фосфат (все субстраты только в D-форме). В эритроцитах фермент поставляет НАДФН для метгемоглобинредуктазы и глутатионредуктазы, в надпочечниках – для восстановления аскорбиновой кислоты, участвующей в синтезе стеро-

64

идных гормонов. Восстановленный НАДФ также необходим для синтеза жирных кислот и холестерола, поэтому фермент широко распространен

втканях.

Вплазме без гемолиза фермент не выявляется, так как в клетках хорошо структурирован и выходит из них со значительными повреждениями каталитической функции.

Применяется определение активности в гемолизатах для оценки функционального состояния метгемоглобинредуктазных систем эритроцитов, есть генетически обусловленные нарушения активности глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы эритроцитов, приводящие к более быстрому старению и разрушению клеток.

Глутатионредуктаза (К.Ф.1.6.4.2). Широко распространенный фермент, в большом количестве обнаруживается в гепатоцитах, нефроцитах, кардиомиоцитах, эритроцитах и других клетках. Есть НАДФ и НАДНзависимые формы, первые встречаются чаще. Катализирует обратимое

превращение окисленного глутатиона в восстановленный. Глутатион, в свою очередь, поддерживает сульфгидрильные группы белков в необходимом для эффективного функционирования состоянии. В норме можно обнаружить небольшую активность в плазме, куда фермент поступает в основном из разрушенных эритроцитов. Эритроцитарный фермент дает две полосы при электрофорезе. У пациентов с генетическими нарушениями фермента обнаруживается только одна фракция.

Клинически используется только для оценки функционального состояния эритроцитов. Недостаточность сразу трех ферментов: 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредуктазы эритроцитов – причина тяжелых генетически детерминированных (ферментных) форм анемий.

Определение активности по тесту Варбурга, оптимум рН 7,5, фосфатный буфер, НАДФН и окисленный глутатион – в качестве субстратов.

Диаминоксидаза (К.Ф.1.4.3.6). Фермент окисляет гистамин. Первоначально назывался гистаминазой. Проявляет относительную специфичность к гистамину и способен окислять еще некоторые диамины.

Уровень активности в плазме заметно повышается во время беременности, так как он продуцируется плацентой и плодом (норма). Понижение уровня фермента в плазме во время беременности связывают с патологией беременности.

Активность измеряется с помощью изотопных методов, поэтому методика сложна и требует специального оборудования и реактивов. Так как высокие уровни активности определяются в ранние сроки беременности, фермент имеет прогностическое значение. Низкая активность – атрофия плода, внутриутробная гибель и другие осложнения.

65

Б. Трансферазы

Орнитилкарбомоилтрансфераза (К.Ф. 2.1.3.3)/ Ключевой фермент.

цикла мочевины. Осуществляет перенос карбомоильной группировки с карбомоилфосфата на орнитин с образованием цитруллина:

H2N-(CH2)3-CH-COOH + H2N-CO~O-PO3H2

Имеет диагностическую ценность, поскольку цикл мочевины осуществляется только в гепатоцитах. Повышение активности в плазме регистрируется при заболеваниях печени. В норме в сыворотке обнаруживается низкая активность. Оптимум рН варьирует от 6,7 до 7,15. Относительно стабильный фермент, в плазме долго сохраняет свою активность. Устойчив к замораживанию-оттаиванию, ингибируется п-хлормеркуриобензоатом, что свидетельствует о наличие функциональных сульфгидрильных групп в активном центре фермента.

Методы определения активности сложны, применяются радиоактивные изотопы, колориметрический метод очень трудоемок, требует инкубирования сыворотки с цитруллином и арсенатным буфером в течение 24 часов. Затем белок осаждают и определяют ионы аммония по реакции с фенолгипохлоритом.

Клиническое применение. Повышение активности – инфекционный ге-

патит (максимум в период появления желтухи), цирроз (очень высокие значения активности), злокачественные опухоли, токсические поражения печени. Является очень чувствительным тестом-индикатором токсичности различных веществ по отношению к печени. Однако ввиду сложности определения в клинической практике используется редко.

γ-Глутамилтрансфераза (К.Ф. 2.3.2.1). Катализирует перенос γ-глутаминовой группы с γ-глутамилпептида на акцепторный пептид или L-аминокислоту. Активность обнаруживается в ряде органов человека: почках, печени, поджелудочной железе. Имеется несколько изоферментных форм. В норме определяется активность наиболее быстрого изофермента, при гепатите и механической желтухе увеличивается содержание более медленных изоферментов. Локализован фермент в микросомах, принадлежит к частично индуцибельным формам, синтез индуцируется этиловым спиртом и некоторыми лекарственными препаратами. γ-Глут- амилтрансфераза менее чувствительный фермент к нарушениям гепатоцитов, чем аминотрансферазы, однако его активность в плазме заметно повышается при механической желтухе, панкреатите и раке печени, тогда как

66

активность аминотрансфераз в данном случае – норма. Некоторые исследователи отмечают увеличение активности этого фермента в плазме сразу после инфаркта миокарда, но так как в кардиомиоцитах его почти нет, это скорее всего вторично и связано с повреждением при инфаркте гепатобилиарной системы.

Rosalki и Rau (1972)[17] показали, что у лиц, страдающих чрезмерным потреблением алкоголя, сывороточный уровень γ-глутамилтрансферазы коррелирует с потреблением алкоголя и является более чувствительным показателем нарушения функции печени, чем активность аминотрансфераз.

Для определения активности (Rosalki, 1970) используют смесь субстратов γ-глутамил-п-нитроанилида и глицилглицина в трис-буфере с рН 9,0. После добавления сыворотки смесь инкубируют 30 минут при 370С. Реакцию останавливают добавлением уксусной кислоты и регистрируют изменение оптической плотности λ405 нм, ξ= 9900 М-1см-1.

Аспартатаминотрансфераза (К.Ф. 2.6.1.1). Катализирует трансами-

нирование аспарагиновой кислоты в оксалоацетат. Аминогруппа переносится на α-кетоглутаровую кислоту с образованием глутаминовой:

L-Аспартат + α-Кетоглутарат ↔ L-Глутамат + Оксалоацетат

Трансаминирование играет ключевую роль в промежуточном метаболизме, так как обеспечивает и синтез, и разрушение аминокислот в клетке. Особенно активно превращаются путем трансаминирования три аминокислоты: глутаминовая, аспарагиновая и аланин. Они трансаминируются в соответствующие кетокислоты: α-кетоглутаровую, щавелевоуксусную и пировиноградную, которые могут включаться в цикл Кребса. Трансаминирование обеспечивает аспартатом цикл мочевины в гепатоцитах.

Коферментом аминотрансфераз (трансаминаз) служит пиридоксальфосфат, который осуществляет перенос аминогруппы за счет способности образовывать пиридоксаминовые производные с аминокислотами. Пиридоксальфосфат замещает аминогруппу аминокислот-субстратов на карбонильную второго субстрата с промежуточным образованием Шиффовых оснований.

Аспартатаминотрансфераза (АсАТ) – высокоспецифичный фермент, аспартат и оксалоацетат могут быть заменены только на цистеат и кетомаланат соответственно, но реакция идет с очень низкой скоростью. Это достаточно широко распространенный фермент в тканях человека, наиболее богаты этим ферментом гепатоциты, кардиомиоциты, миоциты, нефроциты. Также АсАТ содержится в тканях поджелудочной железы, селезенки, легких, но в значительно меньших количествах. Уровень активности в эритроцитах низкий и слабый гемолиз не оказывает влияния на величину плазменной активности.

67

Определение активности этого фермента в плазме после инфаркта миокарда (La Due et.all., 1954, цит.2) послужило толчком к развитию диагностической клинической энзимологии. В настоящее время это наиболее часто используемый в диагностике ферментативный тест.

При электрофорезе обнаруживаются в экстрактах из кардиомиоцитов

игепатоцитов две основные фракции фермента. Источником катионного изофермента являются митохондрии, анионного изофермента – цитоплазма. Они отличаются по каталитическим константам: оптимуму рН, Кm

ииммунохимическим свойствам. Цитозольные изоферменты из различных клеток идентичны, так же как и митохондриальные.

Вплазму в большом количестве поступает обычно цитозольный изофермент, появление митохондриального – свидетельство значительного повреждения клеток (некроз при инфаркте миокарда).

Определение активности. Методика основана на реакции пирувата с 2,4-динитрофенилгидразином. Оксалоацетат ингибирует фермент, поэтому необходимо, чтобы в ходе реакции он не накапливался. Необходимо избегать фосфатный буфер, ионы фосфата ингибируют митохондриальный изофермент. Метод унифицирован, для определения активности используются наборы реактивов. Существенным недостатком стандартных наборов является относительная нестабильность субстратных смесей, при хранении в них накапливается пируват за счет протекания химической реакции между субстратами.

Клиническое применение. Широко используется для подтверждения диагноза инфаркта миокарда, заболеваний печени и мышц. После инфаркта миокарда уровень активности АсАТ повышается в 4-5 раз и сохраняется в течение 3-5 дней от начала заболевания. При заболеваниях печени наиболее высокие уровни активности дает острый гепатит (в 50 раз от нормы), цирроз. Общая активностьАсАт повышается такжепри мышечнойдистрофии.

Аланинаминотрансфераза (К.Ф. 2.6.1.2). Также широко распространенный фермент, но самое большое количество его содержится в гепатоцитах. Имеет наибольшее диагностическое значение для регистрации повреждений тканей печени. Обратимо катализирует реакцию превращения L-аланина в пировиноградную кислоту:

L-Аланин + α-Кетоглутарат ↔ Пируват + L-Глутамат

Коферментом аланинаминотрансферазы (АлАТ) служит пиридоксальфосфат, фермент проявляет высокую специфичность по отношению к субстратам. В настоящее время отсутствуют данные об изоферментных формах. Для определения активности используется стандартный унифицированный метод, в основе которого реакция пирувата с 2,4- динитрофенилгидразином.

68

Клиническое применение. Высокая активность характерна для заболеваний печени: гепатиты, циррозы, токсические повреждения печени (ядами, химикатами, лекарственными препаратами, токсинами, образующимися в организме при инфекционных заболеваниях и распаде злокачественных опухолей). Широко используемый в клинической практике тест.

Креатинфосфокиназа (К.Ф. 2.7.3.2). Фермент обратимо катализирует фосфорилирование креатина при помощи АТФ:

Креатин + АТФ ↔ Креатин-фосфат + АДФ

Равновесие смещено в сторону обратной реакции, оптимум рН которой 6,8, а скорость прямой реакции максимальна при рН 9,0. Ионы магния, марганца и кальция двухвалентных активируют, а цинка, меди, ртути

иряд тиоловых соединений – ингибируют. Восстановители сульфгидрильных групп – глутатион, дитиотрептол, цистеин – активизируют креатинфосфокиназу (КФК). Фермент содержит в активном центре две тиоловые группы, участвующие в катализе.

Наиболее богаты КФК скелетная мускулатура, значительное количество обнаруживается в кардиомиоцитах, мозге, щитовидной железе, ткани легких. В эритроцитах активности не обнаруживается.

Креатинфосфокиназная реакция регулирует пул аденозинфосфатов. Избыток образованной АТФ активирует передачу макроэргической связи на креатин. Креатинфосфат более стабильное соединение, чем АТФ, и позволяет сохранить энергию для нужд клетки.

КФК отличается множественностью форм – изоформы, конформеры, аллозимы (атипические, патологические формы), наличием макромолекулярных комплексов. Изоферменты представлены цитоплазматическими

иодним митохондриальным изоферментами. Цитоплазматические изоферменты представлены 3 видами: ММ; МВ и ВВ-изоферментами. Все три формы способны к обмену субъединицами. Митохондриальный изофермент также состоит из двух субъединиц, отличных как от М, так и от В-субъединицы.

Вмышцах (скелетной мускулатуре) в основном содержится цитозольный изофермент ММ, а в мозге – ВВ. Изоферментный спектр более сложен в кардиомиоцитах: 1/3 активности КФК представлена митохондриальным изоферментом, 1/3 цитозольным ММ изоферментом и 1/3 цитозольным МВ изоферментом. Конформеры присущи ВВ изоферменту, они представляют собой его структурные варианты. Макромолекулярные комплексы разнообразны: (1) высокомолекулярные комплексы ВВ с гаммаглобулинами G и A; (2) высокомолекулярные агрегаты митохондриального изофермента с белками внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий, где он структурирован; (3) комплексы ММ-изоформы с липопротеидами и некоторыми другими белками; (4) полимеры, образованные не-

69

сколькими молекулами КФК. Атипичные формы КФК по некоторым данным [15] – гликозилированные молекулы фермента.

Активность и изоферментный спектр КФК – прекрасный тест на морфологическое и функциональное состояние различных клеток и тканей организма. В эмбриогенезе изменение активности идет параллельно с дифференциацией тканей. При формировании мышечного волокна возрастает активность КФК за счет замены ВВ изофермента на ММ изофермент. При мышечной дистрофии происходит возврат к ВВ типу.

Креатинфосфокиназа – в основном конститутивный фермент, но может индуктивно синтезироваться под действием инсулина, тироксина, эстрадиола, креатина. Четкая локализация КФК и ее изоферментов определила высокую значимость для использования с целью диагностики, прогнозирования, регистрации тяжести течения заболевания.

Увеличение активности КФК в плазме крови регистрируется при инфаркте миокарда и служит наиболее специфическим тестом при постановке диагноза даже при отсутствии характерных изменений ЭКГ. По изоферментному спектру можно рассчитать и зону некроза. Сроки нормализации, а также рецидивные повышения активности – незаменимые показатели для терапевта при разработке тактики лечения. Определение КФК-ной активности и изоферментного спектра весьма информативны также при прогрессирующей мышечной дистрофии и полимиозитах. Повышение активности регистрируется у практически здоровых людей при сверхвысоких физических нагрузках и является неблагоприятным признаком.

Определение активности. Один из методов основан на реакции креатинфосфата и АДФ, образующийся при этом креатин реагирует с α-нафтолом, диацетил служит катализатором этого взаимодействия (метод Коровкина), интенсивность розового окрашивания измеряется фотометрически. Унифицированный метод основан на сопряженных реакциях и требует присутствия в инкубационной среде двух ферментов:

КФК Креатин-фосфат + АДФ ↔ Креатин + АТФ

АТФ + Глюкоза → Глюкозо-6-фосфат + АДФ Гексокиназа

Глюкозо-6-фосфат + НАДФ → 6-Фосфоглюколактон + НАДФН + Н+ Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

Активность регистрируется по изменению оптической плотности на длине волны 340 нм (тест Варбурга). Протеканию этих реакций мешает аденилаткиназа, катализирующая реакцию:

2АДФ ↔ АТФ + АМФ Аденилаткиназа

70