Клиническая биохимия / Кленова Н.А. Биохимия патологических состояний

с усилением использования карбомоилфосфата для синтеза пиримидиновых оснований, где промежуточным продуктом является оротат.

Цитруллинемия вызвана дефектом аргининсукцинсинтетазы, катализирующей взаимодействие цитруллина и аспарагиновой кислоты с образованием аргининсукцината. Клинические проявления могут варьировать от смерти в новорожденный период до гиперцитруллинемии во взрослом состоянии. Наблюдается рвота, в основном после приема богатой белком пищи, иногда сопровождается увеличением печени. В моче обнаруживаются повышенное содержание нейтральных и кислых аминокислот, чрезмерное накопление цитруллина (в сотни и тысячи раз от нормальных значений).

Аргининянтарная аминоацидурия обусловлена дефектом аргининсукциназы, расщепляющей аргининсукцинат на аргинин и фумаровую кислоту. При остром течении у новорожденных наблюдаются плохое сосание, повышенная сонливость, учащенное дыхание, судороги. Обычно младенцы редко доживают до трехмесячного возраста. Подострая форма, связанная с уменьшением активной концентрации фермента, регистрируется трудность вскармливания, задержка психомоторного развития, часто – тонкие крошащиеся волосы. Лабораторно характерно выделение аргининянтарной кислоты до 9 г/сутки. Активность аргининсукциназы снижена в эритроцитах, лейкоцитах, печени и почках.

Недостаточность аргиназы – фермента, расщепляющего аргинин на мочевину и орнитин (завершающая реакция цикла мочевины). Чаще всего сильный дефект фермента приводит к гибели ребенка в период новорожденности. В крови, моче и спинномозговой жидкости значительно повышено содержание аргинина, в плазме – ионов аммония, снижена активность аргиназы в эритроцитах.

Недостаточность орнитинаминотрансферазы, катализирующей синтез глутаматполуальдегида из орнитина с последующим образованием гуанидинацетата и креатина. Затрагивает процессы обмена креатина, характеризуется снижением остроты зрения из-за атрофии сетчатки, мышечной слабостью.

Нарушения креатин-креатининового обмена. В организме поддержи-

вается постоянный уровень креатина во всех тканях и в крови. Превращение креатина в креатинин – реакция необратимая и креатинин, образовавшийся из креатина в мышцах, удаляется с мочой. Процессы распада белков и аминокислот сопровождаются усилением превращения креатина

вкреатинин. Соотношение показателей мочевина-креатинин в плазме крови используется в оценке почечных нарушений. Однако концентрация креатинина в сыворотке – малочувствительный тест почечной функции, так как уровень креатина не повышается, пока скорость гломерулярной фильтрации не снизится на 50% от нормы. Увеличение уровня креатина

вплазме регистрируется при любой патологии, сопровождающейся усиле-

101

нием распада белков: сильные ожоги, гангрена, туберкулез, злокачественные опухоли.

Белковые фракции крови при некоторых заболеваниях

Наибольшее значение имеет белковый коэффициент крови: отношение альбуминов к глобулинам. У здоровых людей белковый коэффициент составляет 1,2-2,2. Патологическим является только снижение коэффициента, которое наблюдается при острых гепатитах, нефрозах, сильных воспалительных процессах, туберкулезах. Различные заболевания характеризуются однообразным ответом: снижением фракции альбумина и увеличением глобулинов.

Процентное содержание основных фракций белков в плазме крови изменяется с возрастом: у новорожденных больше фракция γ-глобулинов, к трем годам наблюдается приближение к обычным значениям у взрослых людей, кроме β-глобулинов, содержание которых у детей меньше. С возрастом фракция альбуминов уменьшается, а глобулинов увеличивается, то есть белковый коэффициент постепенно снижается.

Острые инфекционные заболевания характеризуются нормопротеи-

немией, незначительной гипоальбуминемией, повышением содержания α1- и α2-глобулинов, γ – норма или небольшое увеличение.

Хронические воспалительные процессы – повышение содержания

γ-глобулинов при норме или увеличении α1- и α2-глобулинов. Уровень α-глобулинов, особенно α2-глобулинов, служит признаком активности инфекционного процесса.

Нарушения в содержании глобулинов при острых и хронических нефритах сходны с нарушениями, наблюдаемыми при других острых и хронических воспалительных процессах.

Нефрозы характеризуются значительной гипопротеинемией в результате потери белков с мочой. Значительное увеличение α2-глобулинов при снижении содержания альбуминов – дифференциально-диагностический признак нефрозов.

Гепатиты сопровождаются гипопротеинемией, гипофибриногенемией, гипоальбуминемией, повышением содержания β- и γ-глобулинов.

Ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертония, атероскле-

роз – наблюдается увеличение β-глобулинов, транспортирующих липиды. При инфаркте миокарда наблюдается длительное повышение содержания α2-глобулинов, в то же время увеличение α1 и β-глобулинов – крат-

ковременно.

Особый вид патологий белков плазмы – дефектопротеинемии. Афибриногенемия – врожденное заболевание, связанное с дефектом

синтеза фибриногена, по клиническому течению близко к гемофилии.

Агаммаглобулинемия и гипогаммаглобулинемия – врожденные анома-

лии, характеризующиеся отсутствием или снижением количества антител

102

в плазме. Пациенты страдают уменьшением сопротивляемости организма к инфекциям и хроническими воспалительными процессами.

Выделение белков с мочой (протеинурия) в норме отсутствует. Про-

теинурии наблюдаются прежде всего при функциональных расстройствах почек: пиелонефритах, гломерулонефритах, нефросклерозах. Лихорадки и токсикозы различной этиологии сопровождаются протеинурией из-за функционального напряжения почек.

Неспецифическая агрегация белков. «Конформационные болезни»

Неправильный фолдинг и агрегация белков с образованием нерастворимых внутриклеточных комплексов и телец включения лежат в основе патогенеза значительной части дегенеративных и нейродегенеративных заболеваний у человека. Такие заболевания, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, болезнь Мачадо-Джозефа (спи- нально-мозжечковая атаксия), прионные энцефалопатии, боковой амиотрофический склероз – болезнь Шарко, системный амилоидоз, фибрознокистозная дегенерация, представляют собой лишь часть заболеваний, известных в настоящее время как «конформационные болезни» [9,12].

Агрегация белков происходит при «ошибочных» взаимодействиях полностью или частично развернутых белковых молекул, приводящих к образованию агломератов произвольной формы. В основе агрегации лежат контакты гидрофобных поверхностей частично развернутых белков, что сопровождается ростом структурированных или аморфных агрегатов, характеризующихся низкой растворимостью в воде или детергентах и ненативной вторичной структурой. Белки в агрегированном состоянии функционально неактивны и во многих случаях обогащены антипараллельными β-цепями. Агрегация белков in vivo осуществляется как во внутриклеточных компартментах, так и во внеклеточном пространстве, если образование неправильно свернутых белков превышает способность клетки их деградировать. В клетках агрегация белков может быть следствием неправильного фолдинга, обусловленного ошибочным включением аминокислот в полипептиды в связи с мутациями или ошибками в трансляции, процессинге мРНК и трансляции. Помимо этого неблагоприятные факторы окружающей среды, такие как тепловой, окислительный и осмотический стрессы, а также продукты вирусных генов, способны оказывать влияние на фолдинг и ускорять агрегацию белков [9,12].

Согласно данным современных исследований, шаперонзависимая дезагрегация белковых агрегатов в клетках служит главным средством для восстановления нативных белков из токсичных агрегатов, таких, как обогащенные полиглутамином белки, амилоидные бляшки и прионы. Уменьшение экспрессии шаперонов типа Нsp в случае апоптоза или при старении организма может вызывать каскад внутриклеточных изменений, приводящих к агрегации белков.

103

Изучение процессов синтеза белков на рибосомах и фолдинга показало, что до 30% вновь синтезированных внутриклеточных белков дефектны и вскоре после синтеза расщепляются. Деградация основной части белков в клетках млекопитающих осуществляется убиквитин-протеазной системой, в частности 26S-протеасомами, обычно после связывания белков с полиубиквитиновой системой. Протеасомы распространены по всей цитоплазме и обнаруживаются также в ядре клеток эукариот. Цитоплазматические протеасомы связаны с центросомами, сетью цитоскелета и внешней мембраной ЭПС [9].

Отложение неправильно свернутых белков с образованием телец включения в нейронах является общим свойством многих нейродегенеративных заболеваний, что позволяет предположить существование общих для этих заболеваний механизмов, связанных с неспособностью нейронов эффективно удалять неправильно свернутые белки. Агрегация полипептидных цепей, подвергнутых неправильному фолдингу, приводит к образованию нерастворимых ядерных и цитоплазматических телец включения, токсичных для клеток. При аутопсии головного мозга людей, страдающих болезнью Альцгеймера, выявляются два типа отложений: внеклеточные отложения – амилоидные нейритные бляшки, представляющие собой отложения β-амилоидного пептида (βА), и внутриклеточные скопления нейрофибриллярных сплетений, представляющие собой пучки парных спиральных филаментов гиперфосфорилированного белка тау, связанного

смикротрубочками нейронов. βА является продуктом деградации трансмембранного амилоидного белка-предшественника (АРР), процессинг которого происходит под действием α-, β-, γ-секретаз. В результате процессинга АРР в нормальных, физиологических условиях образуется растворимая форма βА, которая не образует агрегатов. При наследственной форме болезни Альцгеймера, связанной с мутацией гена, кодирующего АРР, образуется гидрофобный βА, который агрегирует, становясь зародышем образования амилоидных фибрилл, являющихся матрицей для формирования бляшек.

Болезнь Паркинсона характеризуется образованием цитоплазматических белковых телец включения, известных как тельца Леви, и гибелью дофаминергических нейронов среднего мозга. Развитие болезни Паркинсона определяется отложением белков α-синуклеина и паркина, которые обнаруживаются в тельцах Леви. Полагают, что образование отложений α-синуклеина и паркина обусловлено мутацией этих белков и нарушением их деградации в убиквитин-протеасомной системе [9].

Нейрогенеративные полиглутаминовые болезни, характеризующиеся расстройством координации движений, такие как болезни Хангтингтона и Мачадо-Джозефа, вызываются одним и тем же типом мутаций. В результате генетического сбоя клетки начинают синтезировать аномальные белки

сдлинным хвостом, состоящим из повторяющихся остатков глутамина.

104

Нормальная форма белка содержит не более 20 повторений остатков глутамина, а мутантная – 40 остатков и обладает повышенной способностью к агрегации.

Образование мутантных форм внутриклеточного прионного белка PrP лежит в основе патогенеза прионных болезней – инфекционных, спорадических или наследственных нейрогенеративных заболеваний млекопитающих [10,12]. У человека наиболее известны болезнь Крейцфельда-Якоба и синдром Гертсмана-Штраусслера-Шейнкера, а у овец – скрейпи (почесуха) и у крупного рогатого скота – губчатая энцефалопатия (коровье бешенство). Нативная форма PrP белка представляет собой мембраносвязанный гликопротеин, характеризующийся высоким содержанием α-спиралей и низким содержанием β-структур. Он растворим в детергентах, чувствителен к действию протеолитических ферментов и не склонен к агрегации. В настоящее время известно несколько мутантных форм прионных белков, вызывающих болезнь Крейцфельда-Якоба (Prp V2031, E211Q), и один, характерный для синдрома Гертсмана-Штраусслера-Шейнкера (PrpQ212P). Наиболее же изученной является инфекцирующая форма прионного белка PrPSc – причина инфекционной губчатой энцефалопатии. PrPSc образуется вследствие неправильного фолдинга, в основном имеет складчатую β-структуру, нерастворим в детергентах и устойчив к действию протеолитических ферментов. Прионные белки склонны к агрегации и формируют амилоидоподобные фибриллы, нарушающие функции клеток.

Образование высокомолекулярных нерастворимых комплексов агрегированной супероксиддисмутазы (СОД) является причиной развития наследственного заболевания – бокового амиотрофического склероза, сопровождающегося дегенерацией двигательных нейронов в коре и стволе головного мозга, а также в спинном мозге. В исследованиях in vitro и in vivo показано, что мутантные формы СОД подвергаются неправильному фолдингу и приобретают повышенную способность к агрегации, что приводит к образованию телец включения и патологическим изменениям двигательных нейронов [9,12].

Причинно-следственная связь между агрегацией белков и нейродегенерацией в настоящее время в деталях еще не выяснена. Общепринято, что при многих наследственных нейродегенеративных заболеваниях агрегация белков занимает центральное место в причинах гибели клеток, однако не выяснено являются ли белковые агрегаты причиной или следствием нейротоксичности.

Обнаружено, что сформированные в клетках агресомы могут связываться с лизосомами и расщепляться с повышенной скоростью. На основании этого предполагается защитная роль образования клетками телец включения для ускорения деградации токсичных белков. Патологии, возникающие при наличии в клетках большого количества агрегированных белков, могут быть следствием повреждения системы их быстрой утилиза-

105

ции, отсутствия функционально активных форм данных белков и повышенной токсичности мутантных форм.

Нарушения обмена некоторых белков

Из встречающихся нарушений отдельных белков наибольший интерес представляют изменения в метаболизме гемоглобина, муцинов и мукоидов, коллагенов.

Обмен гемоглобина. Гемоглобин человека является далеко не однородным белком. В крови здоровых людей содержится 98% гемоглобина А (НbА) и 0,2-1% гемоглобина F (HbF)(фетальный). У эмбрионов 80% гемоглобина приходится на HbF, у новорожденных – 20%. Известно около 30 типов патологических форм гемоглобина, обозначаемых подряд буквами латинского алфавита, начиная с С. Определение типов гемоглобина имеет значение для диагностики формы анемии:

(1)Талассемия – количество НbF от 50 до 90% (тяжелая форма). Фетальный гемоглобин обладает высоким сродством к кислороду, что приводит к нарушению его отдачи в тканях.

(2)Врожденная гемолитическая анемия. Обнаруживается гемоглобин

D, C. Эритроциты характеризуются более жесткой мембраной, преобладают сфероциты, которые улавливаются селезенкой и разрушаются.

(3)Серповидноклеточная анемия. Характерен HbS, имеющий 3 сульф-

гидрильные группы, отличающийся большей гидрофобностью. Комбинация HbA + HbM описана при наследственной метгемоглоби-

немии. Подробнее анемии, связанные с патологией гемоглобина, рассмотрены в первой главе (раздел 1.2.). Снижение содержания гемоглобина обозначается как анемия, повышение обычно сопровождается увеличением количества эритроцитов – эритремии. Содержание гемоглобина в плазме в норме не должно превышать 10 мг%, увеличение свидетельствует о внутрисосудистом гемолизе.

Появление гемоглобина в моче – гематурия – сопровождает травматические повреждения мочевыводящих путей, полипы мочевого пузыря.

Первичные гематурии делят на спортивные (перегрузки), холодовые

(сильно переохлаждение), гемолитические (внутрисосудистый гемолиз). Вторичные гематурии наблюдаются при токсикозах, особенно при отравлениях сульфаниламидами; переливании несовместимой крови, сильных инфекциях (сепсис, тиф, тяжелая ангина, скарлатина и т.п.).

Синтез порфиринов и его нарушения. Порфирины – это цикличе-

ские соединения, образованные четырьмя пиррольными кольцами, связанные между собой метенильными мостиками. Характерным свойством порфиринов является их способность образовывать комплексы с ионами металлов, связывающимися с атомами азота пиррольных колец. Гемы представляют собой железопорфирины. Порфирии – редкие заболевания, обусловленные нарушением биосинтеза порфиринов. Заболевания часто

106

сопровождаются желтухой, вызванной либо чрезмерным образованием билирубина, либо нарушением его экскреции. А желтухи характерны для многих болезней от вирусного гепатита до холестаза. Исходным субстратом для синтеза порфиринов служит сукцинил-КоА и глицин. Необходима активация глицина пиридоксальфосфатом, который образует с ним шиффово основание; затем α-углерод глицина присоединяется к карбонильному углероду сукцината. Продуктом конденсации является α- амино-β-кетоадипиновая кислота, которая быстро декарбоксилируется с образованием δ-аминолевулеата (АЛК). Реакция катализируется АЛКсинтетазой. Синтез АЛК осуществляется в митохондриях и лимитирует скорость образования гемовых структур в гепатоцитах млекопитающих. В цитозоле другой фермент – АЛК-дегидратаза катализирует конденсацию двух молекул АЛК с образованием двух молекул воды и одной молекулы порфобилиногена. Фермент является Zn-содержащим и ингибируется ионами свинца. Образование порфирина идет путем конденсации четырех монопирролов, образующихся из порфобилиногена. Встречающиеся в природе порфирины являются соединениями, у которых 8 атомов водорода порфиринового ядра замещены различными боковыми группами. Из них основополагающими служат уропорфирины (I тип) и

копропорфирины (III тип). Порфириями называют гетерогенную группу заболеваний, характеризующихся повышенным выделением порфиринов или их предшественников. Некоторые формы порфирий являются наследственными, другие – приобретенными. Наследственные формы де-

лят на эритропоэтические, печеночные и смешанные. Для большинства наследуемых форм характерно наличие метаболических нарушений во всех тканях, однако проявляются они по каким-то причинам в каком-то одном типе тканей.

Перемежающаяся острая порфирия (ПОП) – аутосомно-доминатная наследственная болезнь человека, которая обычно проявляется только при достижении половой зрелости. Ее причиной является частичная недостаточность уропорфириноген-1-синтетазы. Гетерозиготные больные имеют 50% от нормы активности фермента, с мочой экскретируют большие количества порфобилиногена и АЛК. Оба соединения бесцветны, но порфобилиноген на свету и воздухе образует два окрашенных в темный цвет продукта – порфобилин и порфирин. Болезнь сопровождается острыми болями в животе, рвотой, запором, сердечно-сосудистыми нарушениями, нерв- но-психическими расстройствами. На основании механизма регуляции синтеза АЛК-синтазы системой репрессии-дерепрессии, введение больным гематина может уменьшить индукцию АЛК-синтазы и облегчить протекание заболевания.

107

Врожденная эритропоэтическая порфирия – редкое врожденное за-

болевание, наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Молекулярная природа болезни точно не выяснена. Установлено, что для заболевания характерен определенный дисбаланс относительных активностей уропорфи- риноген-III-косинтазы и уропорфириноген-I-синтазы. Образование уропорфириногена I в количественном отношении значительно превышает синтез уропорфириногена III, необходимого изомера на пути синтеза гема. Проявляется прежде всего в гемапоэтической ткани костного мозга. Пациенты экскретируют большие количества изомеров I типа уропорфириногена и копропорфириногена, которые в моче превращаются в уропорфирин I и копропорфирин I – красные флуоресцирующие пигменты.

Вероятно, вследствие образования меньших количеств истинного предшественника гема, уропорфириногена III, и возникающего относительного дефицита гема в эритропоэтических тканях происходит индукция АЛК-синтазы. Она приводит к перепроизводству порфириногенов типа I и повышению образования и экскреции порфобилиногена и АЛК. Развиваются симптомы, похожие на ПОП, но, кроме этого, отмечаются светочувствительность кожи, трещины на коже, гемолитические явления.

Наследственная копропорфирия – аутосомно-доминатное нарушение, обусловленное дефицитом копропорфириногеноксидазы. Это митохондриальный фермент, осуществляющий превращение копропорфириногена III в протопорфириноген (рис.2.3).

Копропорфириноген III в больших количествах удаляется из организма в составе фекалий и с мочой. Как и уропорфириноген, копропорфириноген на свету и воздухе быстро окисляется, превращаясь в красный пигмент копропорфирин. Ограниченная способность к синтезу гема приводит к избыточному образованию АЛК и порфобилиногена и появлению у пациентов всех симптомов, связанных с избытком АЛК. При этом заболевании введение гематина также может вызвать по крайней мере частичную репрессию АЛК-синтазы и смягчение симптомов, обусловленных перепроизводством интермедиатов биосинтеза гема.

108

Гемопротеииы

Гем + Апобелки

Fe2+ Феррохелатаза

Протопорфирин

Протопорфириноген

Копропорфириноген Копропорфирин

Уропорфириноген Уропорфирин

Порфобилиноген

АЛК-синтаза

АЛК

Сукцинил-КоА + Глицин

Рис. 2.3. Последовательные стадии синтеза гемсодержащих белков [10]

Мозаичная порфирия – аутосомно-доминантное нарушение, при котором происходит частичное блокирование ферментативного превращения протопорфириногена в гем. В норме это превращение осуществляется фер-

ментами протопорфириногеноксигеназой и феррохелатазой. Оба фермен-

та имеют локализацию в митохондриях. У пациентов с мозаичной порфирией наблюдается относительная недостаточность содержания гема в стрессовых условиях, а также дерепрессированное состояние печеночной АЛК-синтазы. Больные экскретируют с мочой избыточное количество АЛК, порфобилиногена, уропорфирина и копропорфирина, а с фекалиями выделяют уропорфирин, копропорфирин и протопорфирин. Моча больных пигментирована и флуоресцирует, а кожа чувствительна к свету так же, как и у нижеприведенной группы нарушений.

Поздняя кожная порфирия. Является, возможно, наиболее распространенной формой порфирий. Обычно она связана с повреждением пече-

109

ни алкоголем или токсинами (ионы тяжелых металлов). Вероятной причиной может быть частичная недостаточность уропорфириногендекарбоксилазы. Нарушения, вероятно, передаются аутосомно-доминантным путем, но пенетрантность зависит от функционального состояния печени. Моча больных содержит повышенные количества уропорфиринов типа I и III; в то же время экскреция с мочой АЛК и порфобилиногена наблюдается редко.

Главным клиническим проявлением поздней кожной порфирии служит повышенная светочувствительность кожи.

Протопорфирия или эритропоэтическая порфирия обусловлена до-

минатно наследуемой недостаточной активностью феррохелатазы в митохондриях всех тканей. Клинически болезнь проявляется как острая крапивница, вызываемая воздействием солнечных лучей. Эритроциты, плазма и фекалии больных содержат повышенные количества протопорфирина IX, а ретикулоциты и кожа часто флуоресцируют красным светом.

Приобретенная (токсическая) порфирия может быть вызвана действием токсических соединений, таких как гексахлорбензол, соли свинца и других тяжелых металлов, а также лекарственными препаратами. Тяжелые металлы являются ингибиторами ряда ферментов в системе синтеза гема, включая АЛК-дегидратазу, уропорфириногенсинтетазу и феррохелатазу.

Распад гема и его нарушения. Разрушение эритроцитов и распад гемоглобина осуществляются в печени, селезенке и тканях костного мозга. Гемоглобин транспортируется в данные клетки при участии гаптоглобина. При поступлении в клетки от белка сначала отщепляется гем, который через ряд промежуточных стадий превращается в желчные пигменты – били-

рубин и биливердин.

При условиях физиологической нормы в организме человека разрушается 1-2·108 эритроцитарных клеток в час. Белковая часть гемоглобина может быть либо снова использована, либо подвергнута расщеплению до аминокислот; железо гема включается в общий пул и также снова используется. Свободная от железа порфириновая часть гема обязательно деградирует. Это происходит в микросомальной фракции ретикулоэндотелиальных клеток печени, селезенки и костного мозга с помощью сложной ферментативной системы – гемоксигеназной. Сначала гем превращается в гемин за счет окисления железа в ферриформу; затем гемин связывается

сальбумином с образованием метгемальбумина. Гемоксигеназная система является индуцибельной и локализуется вблизи микросомальной системы транспорта электронов. Гемин сначала восстанавливается в ферроформу

спомощью НАДФН и гидратируется по α-метенильному мостику между

пирррольными кольцами I и II с использованием еще одной молекулы НАДФН, а железо снова окисляется в Fe3+. При последующем присоединении кислорода происходят освобождение феррииона, выделение молекулы окиси углерода и образование в результате раскрытия тетрапиррольного

110