Клиническая биохимия / Кленова Н.А. Биохимия патологических состояний

лизосомальных ферментов и активации каспаз и гибели клеток. В некоторых случаях это приводит к феноптозу – запрограммированной смерти организма. Как оказалось, во многих случаях гибель клеток обусловлена не только внешними, но и внутренними причинами. Некоторые штаммы E.coli образуют неактивную форму специфической протеазы. Если бактериальная клетка заражается определенным вирусом, один из небольших вирусных полипептидов связывается с протеазой и активирует ее. Активированная протеаза расщепляет фактор элонгации EF-TU и, прекращая синтез белка, убивает клетку, что ограничивает размножение бактериофага и спасает популяцию от инфекции.

Многие тяжелые заболевания сопровождаются массовой продукцией ФНО и других цитокинов, индуцирующих апоптоз. Например, септический шок – смерть организма, хорошо спланированная самим организмом. Нарастание медиаторов воспаления, гиперпроизводство АКМ нейтрофилами и макрофагами, активация ПОЛ и ксантиноксидазы ведет к активации каспаз, определенной группы протеолитических ферментов, стимулирующих апоптоз. Высокий уровень гибели функционально важных клеток организма может привести к феноптозу – смерти организма. Подобная программа гибели всего организма, вероятно, сформирована в ходе эволюционного процесса и оправдана остановкой распространения опасной инфекции в популяции [25].

Опасность ускорения апоптозной гибели клеток резко возрастает в условиях перехода от состояния гипоксии (недостатка снабжения клеток кислородом) к реоксигенации (восстановлению высокого содержания кислорода в тканях). Это происходит в результате некоторого накопления в условиях недостатка кислорода восстановленных форм железа (Fe2+). При реоксигенации возрастает вероятность реакции Фентона:

Н2О2 + Fe2+ → ОН• + ОН- + Fe3+.

Кроме того, в условиях увеличения парциального давления кислорода в тканях индуктивно сопровождается повышением продукции ксантиноксидазы и, соответственно, АКМ. При ишемии миокарда реокисигенации наиболее опасна, так как может стать причиной стимуляции апоптозной гибели большого числа клеток, окружающих зону некроза и сделать нормальную работу миокарда невозможной. Затормозить апоптоз, вызванный реоксигенаций, можно с помощью антиоксидантов и ингибиторов каспаз

(рис.3.1).

Аноксия

171

Взрыв АКМ при реоксигенации

Антиоксиданты, ингибиторы каспаз

Апоптоз клеток – суперпродуцентов АКМ и соседних клеток Дисфункция жизненно важных органов

Смерть организма

Рис.3.1. Пути развития апоптоза и феноптоза в условиях перехода от аноксии к реоксигенации [25]. Пунктирными стрелками показаны возможные блокирующие воздействия

Гибель организма от инфаркта и инсульта во многом определяется уровнем апоптозной гибели клеток жизненно важных органов, однако стойкое снижение запрограммированной гибели клеток означает повышение риска развития злокачественных новообразований.

В.П. Скулачев (1999)[25], выдвигающий гипотезу запрограммированной смерти организма (феноптоза) как результата чрезмерной апоптозной гибели функционально важных клеток, предлагает стратегию блокирования основных путей развития апоптоза с целью предотвращения феноптозной гибели. Основные возможности блокирования на настоящий момент показаны на рис.3.1 стрелками с пунктирной линией. Согласно В.П. Скулачеву, защита от окислительного стресса может осуществляться как результат «мягкого» разобщения дыхания и фосфорилирования, сопряженного с возрастанием скорости потребления кислорода и снижением уровня восстановления компонентов дыхательной цепи. Это приводит к снижению концентрации кислорода и скорости продукции АКМ в клетках. Механизм мягкого разобщения может быть основан на обратном открытии неселективных пор во внутренней мембране митохондрий. Экспериментально показано, что низкие концентрации прооксидантов, в частности АМК, могут индуцировать открытие этих пор в митохондриях, активировать дыхание и собственное производство [10].

Молекулярные механизмы развития апоптозной гибели клеток. Осно-

вополагающая работа в этой области принадлежит Керру (1972), который выдвинул гипотезу о существовании двух видов клеточной смерти: апоптоза и некроза. Апоптоз представляет собой многоэтапный процесс, начинающийся внутри клеток после принятия сигнала, гибель клетки осуществляется по определенной программе. Морфологически наблюдается перераспределение фосфолипидов в цитоплазматической мембране, переме-

172

щение фосфатидилсерина из внутреннего монослоя ЦПМ в наружный, сморщивание клетки, конденсация ядра, разрывы ДНК, фрагментация клетки в мембранных везикулах. При этом в везикулах сохраняется целостность мембран, формируются апоптозные тельца – фрагменты клеток, окруженные мембраной [19,21].

Этапы реализации программы апоптоза. Начальный момент – прием сигнала к апоптозу. Сигнал может приходить как извне, так и возникать в самой клетке. Существование программы клеточной смерти даже в безъядерных клетках (эритроциты, бактерии) показывает, что наличие ядра не является обязательным для реализации процесса апоптоза. Существует несколько путей индуцирования апоптоза: путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых идет через клеточные рецепторы, специально предназначенные для включения программы клеточной гибели; а также путь, связанный с изменением соотношения регуляторных молекул внутри клеток, мутацией генов, ответственных за регуляторные белки, участвующие в реализации жизнедеятельности клетки.

Вклетках животных и человека апоптоз связан с активацией каспаз, представляющих собой семейство консервативных цистеиновых протеаз, специфично расщепляющих белки после остатков аспарагиновой кислоты. Индукторы апоптоза – факторы некроза опухолей – действуя на рецепторы обычно через ГТФ-зависимые белки, приводят к активации тирозинкиназной активности и фосфорилированию каспаз «первого эшелона». Активированные каспазы «первого эшелона» с помощью ограниченного протеолиза приводят в активное состояние «каспазы второго эшелона» [1,21]. На этапе активации каспаз «первого эшелона» жизнь клетки еще можно спасти, так как существуют регуляторы, которые блокируют их действие.

Кним относятся внутриклеточные регуляторные белки семейства Bcl-2: A1, Bcl-N, Bcl-Xu, Brag-1, Mcl-1, NRB. Однако есть регуляторные белки – промоторы апоптоза, усиливающие действие каспаз. Это белки семейства

Bax: Bad, Bak, Bcl-5, Bik, Bim, Hrk, Bax, Mtd. Соотношение этих регуля-

торных белков и будет определять судьбу данной клетки.

На следующем этапе под действием каспаз «второго эшелона» реализуются следующие события: расщепление белков, блокирующих реализацию программы апоптоза – семейства Bcl-2. Далее – протеолиз ингибитора ДНК-зы, фермента, осуществляющего фрагментацию ДНК. И, наконец, расщепление поли-(АДФ-рибозо)-полимеразы, участвующей в процессах репарации повреждений ДНК. Данный фермент катализирует АДФ-

рибозилирование белков, связанных с ДНК. Донором АДФ-рибозы служит НАД+[21].

Впоследние годы возрос интерес к биологическим функциям сфингозина, метаболита сфинголипидов в реализации программы апоптозной гибели клеток [1]. Установлено, что он является эндогенным ингибитором протеинкиназы С и оказывает таким образом ингибирующий эффект на

173

многие клеточные процессы, зависящие от активации протеинкиназ данного типа, включая процессы пролиферации, дифференцировки и программируемой гибели клеток. Показано, что сфингозин влияет на рост и дифференцировку клеток, агрегацию тромбоцитов, стимуляцию митогенеза, обладает противоопухолевой и бактерицидной активностью. Выяснение механизмов подобной активности сфингозина привело к обнаружению у него способности индуцировать апоптоз. В организмах сфингозин образуется при активации фермента сфингомиелиназы, отщепляющей от сфингомиелина церамид. Далее фермент церамидаза расщепляет церамид с выделением сфингозина.

Взаимодействие сигнальных молекул с рецепторами индуцирует резкую активацию липолитических ферментов (фосфолипазы А2, С, D и сфингомиелиназы), что приводит к накоплению продуктов гидролиза фосфолипидов: арахидоновой кислоты, диацилглицерола, церамида. Однако только продукты сфингомиелинового цикла (церамид и сфингозин) обладают ярко выраженным проапоптозным действием при непосредственном контакте с клеткой. Продукты сфингомиелинового цикла служат токсическим звеном в проведении сигнального апоптоза (рис.3.2)[1].

Таким образом, сфингозин регулирует активность протеинкиназ С , в ядре оказывает влияние на деградацию ДНК путем непосредственного взаимодействия с ней, а также через ингибирование экспрессии Bcl-2.

В нормальном организме программируемая смерть клеток – механизм поддержания гомеостаза и нормального функционирования организма, освобождение от ненужных клеток, выполнивших свою функцию, трансформированных или поврежденных клеток. Чрезвычайно часто апоптоз встречается у растений, этот механизм клеточной гибели лежит в основе реализации многих процессов жизнедеятельности растений [21].

174

Блокирование

Ингибирование экспрессии Bcl-2

АПОПТОЗ

Рис. 3.2. Схема участия сфингозина в апоптозе [1]. Пунктирными линиями показаны процессы, которые блокируются сфингозином

Ксилемогенез и флоэмогенез. Клетки, которым предстоит стать трахеидами ксилемы, претерпевают дробление протоплазмы на везикулы, характерные для апоптоза животных. Те же процессы наблюдаются при развитии ситовидных трубок. Формообразование листьев. Очертания листьев формируются, по-видимому, через реализацию механизма апоптозной гибели. Места перфораций определяются зонами смерти клеток на ранних стадиях развития. Аэрохимогенез – адаптивная реакция растений на дефицит кислорода, заключающаяся в образовании полостей, заполненных воздухом за счет элиминации некоторых клеток с полным разрушением клеточных стенок с участием активирующихся гидролитических ферментов. Клетки корневого чехлика также гибнут по механизму программируемой смерти даже в условиях выращивания растений гидропонным способом.

Опадание листьев и созревших плодов. Эти процессы сопровождаются из-

бирательной гибелью клеток отделительной зоны, расположенной между основанием черешка листа или плода и стеблем, которая активируется благодаря экспрессии так называемых Sag-генов. Клетки в отделительной зоне

175

секретируют ферменты, разрушающие клеточные стенки – пектиназы и целлюлазы. Данные ферменты локально действуют на определенные участки, растворяют частично клеточную стенку в отделительном слое, а сами клетки этой зоны подвергаются автолизису, включая программу апоптозной гибели. Прорастание пыльцевой трубки. Процесс осуществляется в результате гибели клеток на пути прорастающей пыльцевой трубки. Индукторы программируемой клеточной смерти видоспецифичны, выделяются клетками, на которые воздействует пыльца.

В семенах однодольных растений имеются алейроновые клетки, которые секретируют ферменты, катализирующие гидролиз запасных питательных веществ. Будучи ненужными для последующего развития, алейроновые клетки погибают путем апоптоза: ядерная ДНК фрагментируется, образуются везикулярные пузырьки. Процесс стимулируется гибберелловой кислотой и блокируется абсцизовой. Механизм действия: через синтез активаторов или ингибиторов нуклеаз. Апоптозные везикулы у растений разрушаются ферментами, секретируемыми соседними клетками.

Программируемая клеточная смерть лежит у растений и в основе иммунной реакции на патоген. Наряду с индукцией синтеза фитоалексинов и гидролитических ферментов в инфицированных клетках и соседних вблизи очага инфекции, активируется программа собственной гибели. Образуется зона мертвых клеток: обезвоженных, служащих барьером для распространения инфекции. Процесс сопровождается «дыхательным взрывом», генерацией супероксидного радикала при участии НАДФН-оксидазы цитоплазматической мембраны, подобной данному мембранному комплексу нейтрофилов и макрофагов. Кроме НАДФН-оксидазы, в клетках растений образуется перекись водорода при участии пероксидаз клеточной стенки, оксалатоксидазы, а также при окислении НАД-зависимых субстратов или сукцината комплексами I и II дыхательной цепи митохондрий. Этот механизм получил название – гиперчувствительный ответ (ГО), который на одном или нескольких листьях ведет к развитию иммунитета в других листьях, не имевших контакта с патогеном.

Патологической формой гибели клеток является некроз, который в отличие от программируемого апоптоза представляет собой разрыв мембраны клеток и излияние содержимого в межклеточное пространство. Некроз характеризуется разрушением цитоплазматической мембраны и органелл, высвобождением лизосомальных ферментов. Некротической гибели клеток способствует снижение в клетках уровня АТФ и НАД+, ее может провоцировать специальный цитолизирующий комплекс: антиген- антитело-белки комплемента. Между апоптозной и некрозной гибелью клеток в растительных и животных тканях существует взаимосвязь. У растений перекись водорода в малых концентрациях стимулирует апоптоз, а в высоких – некроз. Апоптозная гибель клетки сопровождается расщеплением и фрагментацией ДНК. Чрезмерная активация поли-(АДФ-рибозо)-

176

полимеразы при массированных разрывах ДНК, сильно снижая содержание НАД+, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту некроза. При бактериальном и вирусном заражении большая часть клеток гибнет по варианту некроза, а соседние с ними клетки по варианту апоптоза. Программируемой гибели подвергаются старые или трансформированные клетки [19].

Особую форму апоптоза, вероятно, претерпевают эритроциты млекопитающих. Биогенез эритроцитов из стволовой клетки в костном мозге включает ряд промежуточных этапов. На этапе эритробласта ядро выталкивается из клетки и пожирается макрофагами [21]. Однако существует альтернативное мнение о постепенном кариорексисе (деструкции ядра) с образованием телец Жолли и последующим распадом внутри клетки. Безъядерная клетка, называемая ретикулоцитом, в дальнейшем теряет митохондрии и рибосомы (утрачивая возможность обновления) и превращается в эритроцит. Потерю ядра эритробластом можно рассматривать как особую форму ядерного апоптоза. Лишенный ядра, митохондрий и рибосом, эритроцит, исполнив свое назначение, по-видимому, включает программу гибели, поступая в распоряжение макрофагов печени и селезенки. Так как отдельные эритроциты человека живут от одного до трех месяцев, можно предположить, что выполнение программы апоптоза можно ускорить или затормозить. Очевидно, что скорость реализации программы жизни эритроцита зависит от условий функционирования клеток. Такие факторы как гипоксия, окислительный стресс, наступающий в момент реоксигенации или действия различных прооксидантов, ацидоз и влияние соединений, генерирующих окись азота, способствуя более быстрому повреждению клеток, ускоряют апоптозную гибель эритроцитов[11].

3.2. Нарушения межклеточных взаимодействий.

Канцерогенез [2,4,8,15,17,18, 22]

Эмбриональное развитие, поддержание архитектоники тканей, воспалительный и иммунный ответы, заживление ран представляют собой процессы, связанные как с межклеточным взаимодействием, так и с взаимодействием клеток и межклеточного матрикса.

Взаимодействия клетка-клетка и клетка-межклеточный матрикс обеспечиваются различными семействами рецепторов. В настоящее время идентифицировано несколько семейств адгезивных рецепторов, участвующих в реализации подобного рода взаимодействий: интегрины (гетеродимерные молекулы, функционирующие как клеточно-субстратные, так и межклеточно-адгезивные рецепторы); адгезивные рецепторы суперсемейства иммуноглобулинов (участвуют в межклеточной адгезии и особенно важны в эмбриогенезе, заживлении ран и иммунном ответе); селектины (адгезивные молекулы, лектинподобный домен которых обеспечивает ад-

177

гезию лейкоцитов к эндотелиальным клеткам); кадгерины (кальцийзависимые межклеточные адгезивные белки); хоминговые рецепторы (молекулы, обеспечивающие попадание лимфоцитов в специфическую лимфоидную ткань) [18].

Межклеточные взаимодействия в процессах воспаления и репарации повреждений. При остром воспалительном процессе первым видимым этапом становятся гемодинамические изменения. Сосуды в месте воспаления резко расширяются и возникает стаз клеток крови с последующим выходом лейкоцитов из кровяного русла в месте повреждения органа или ткани. В настоящее время известно, что вазодилатация обеспечивается такими медиаторами воспаления как простациклин ПГI2, эндотелиальным релаксирующим фактором (окись азота). Стимуляция их образования эндотелиальными клетками осуществляется тромбином, гистамином, лейкотриеном С4. Синтез простациклина зависит от дозы агонистов (тромбина, гистамина, лейкотриена), активности фосфолипазы А2 и циклооксиге- назно-простациклинсинтетазного комплекса в эндотелии. Активность последних повышается ИЛ-1 (интерлейкин-1) и ФНОα [Zavoico G.B. et al., 1989, цит.18]. Кроме того, эндотелиальные клетки продуцируют констрикторы, способствующие сокращению гладкомышечных клеток. Но в зоне воспаления, как правило, преобладает вазодилатационный эффект. В зоне воспаления замедляется кровоток и усиливается сосудистая проницаемость. Наблюдается четыре вида изменений эндотелиальных клеток, связанных с усилением проницаемости сосудов: 1) сокращение клеток; 2) реорганизация цитоскелета и контактов этих клеток; 3) повреждение эндотелия с ретракцией, лизисом и отслойкой; 4) отслойка эпителия без лизиса. Сокращение эндотелиальных клеток происходит очень быстро и приводит к усилению проницаемости для жидкости и плазменных белков (но не для клеток крови). Медиаторы воспаления имеют различный срок действия на эндотелий: гистамин вызывает эффекты, продолжающиеся не более 30 минут; некоторые лейкотриены (В4) действуют час и больше. Цитокины вызывают структурную реорганизацию цитоскелета эндотелиальных клеток, что приводит к длительному эффекту увеличения сосудистой проницаемости. Лейкоциты, особенно нейтрофилы и лимфоциты, могут повреждать эндотелиальные клетки с помощью АКМ и протеолитических ферментов, что приводит к их сокращению и лизису, а также к отслойке клеток от подлежащей базальной мембраны. Интерлейкин-1 и ФНОα не повреждают эндотелия, но, активируя лейкоциты, косвенно способствуют его повреждению. Таким образом, процесс развития воспаления характеризуется усилением эндотелиально-лейкоцитарных взаимодействий.

Эндотелиально-лейкоцитарные взаимодействия при воспалении. Ад-

гезия нейтрофилов к эндотелиальным клеткам представляет собой наиболее ранний этап острого воспаления. Степень выраженности аккумуляции

178

нейтрофилов и число адгезированных клеток зависят от природы воспалительного агента. Активация нейтрофилов в гомеостатическом воспалении строго регулируется, но выделение протеолитических ферментов, образование АКМ и производных арахидоновой кислоты способствуют развитию повреждения сосудистой стенки. Нейтрофилы постоянно экспрессируют на своей поверхности адгезивные молекулы, число и функциональный статус которых быстро изменяются в ответ на действие специфических стимулов, к ним относятся прежде всего β2-интегрины и L-селектин. Каждый из трех β2-интегринов постоянно присутствует в плазматической мембране нейтрофилов. Моноклональные антитела против каждого димера ингибируют адгезию нейтрофилов к эндотелию. Врожденный дефицит поверхностной экспрессии β2-интегринов, возникший из-за мутации, заметно снижает аккумуляцию нейтрофилов в местах попадания инфекционного агента или заживления раны [4]. Лектиновый домен L-селектина также вовлекается в процесс адгезии нейтрофилов к эндотелию. После активации этот домен быстро «слущивается» вблизи трансмембранного домена. L-селектин может взаимодействовать с Е-селектином, который появляется на эндотелиальных клетках, активированных цитокинами. β2-Интегрины и L-селектин могут синергично взаимодействовать при миграции нейтрофилов в зону воспаления. Полагают, что L-селектин обеспечивает эффект «катящихся» нейтрофилов по поверхности эндотелиальных клеток. Лиганды на эндотелиальных клетках, которые взаимодействуют с L-селектином на «катящихся» нейтрофилах, пока не идентифицированы. Начальное связывание, обеспечиваемое L-селектином, может быть важным этапом для дальнейшей работы интегриновой системы. Быстрое слущивание L-селектина и функциональное усиление авидности β2-интегринов лежат в основе механизма контроля нейтрофил-эндотелиального взаимодействия, регулируемого адгезивным фенотипом нейтрофилов [Zimmerman G.A. et al.,1990, цит.18].

Клетки активированного эндотелия синтезируют ряд биологически активных молекул, в частности ФАТ (фактор активации тромбоцитов), обеспечивающих адгезию гранулоцитов к эндотелиальным клеткам. ФАТ постоянно не присутствует в покоящихся эндотелиальных клетках, но синтезируется в течение нескольких минут после их стимуляции тромбином, гистамином, лейкотриеном С4 и другими агонистами. Синтез ФАТ требует активации с помощью фосфорилирования Са2+-зависимой фосфолипазы А2 и специфической ацетилтранферазы. Он не выделяется эндотелием в жидкую среду, а экспрессируется на поверхности мембраны в виде мембраносвязанного медиатора и активирует нейтрофилы при взаимодействии с поверхностным рецептором лейкоцитов. Данный рецептор принадлежит к семейству ГТФ-зависимых белков (G-белков). Связывание этого рецептора с ФАТ усиливает экспрессию семейства β2-интегринов (CD11a/CD18; CD11b/CD18). Явление адгезии и активации клеток-мишений мембранос-

179

вязанными молекулами других клеток получило название юстакринной активации. Юстакринная активация нейтрофилов мембраноассоциированным ФАТ вызывает усиление ответа гранулоцитов на действие хемотаксических факторов, так как стимулирует слущивание L-селектина.

Под влиянием другой группы агонистов – ИЛ-1, ФНОα и липополисахаридов бактериальных клеток – эндотелиальные клетки синтезируют другую сигнальную молекулу – ИЛ-8. После стимуляции эндотелия синтез ИЛ-8 осуществляется в течение 4-24 ч. Он является потенциальным хемоаттрактантом для нейтрофилов и может влиять на трансмиграцию лейкоцитов в случае синтеза его эндотелием. В отличие от ФАТ большая часть его выделяется в жидкую фазу, а меньшая остается связанной с базальной мембраной эндотелия. ИЛ-8 активирует нейтрофилы, связываясь со специфически рецептором, также принадлежащим к семейству G-белков. В результате действия ИЛ-8 повышается плотность β2-интегринов, усиливается адгезия нейтрофилов к покоящимся эндотелиальным клеткам и субэндотелиальному экстрацеллюлярному матриксу (ЭЦМ), но уменьшается адгезия к цитокинактивированному эндотелию, экспрессирующему Е-селектин. Механизм подобного ингибирования лейкоцитарной адгезии пока неизвестен, но может быть связан со слущиванием L-селектина на активированных ИЛ-8 нейтрофилах [Smith C.W. et al., 1991, цит.18].

Подобно нейтрофилу, эндотелиальные клетки экспрессируют на своей поверхности ряд адгезивных молекул. Кроме лигандов для L-селектина и β2-интегринов идентифицированы Р и Е-селектины. Р-селектин транслоцируется из эндотелиальных секреторных гранул на поверхность клеток после стимуляции их тромбином или гистамином, затем происходит его быстрая интернализация. Такая транзиторная экспрессия происходит параллельно с адгезией нейтрофилов к активированному эндотелию (рис.3.3), обеспечивая механизм временной регуляции адгезивного взаимодействия. Так как активация эндотелиальных клеток определенными оксидантами пролонгирует экспрессию Р-селектина на поверхности клеток, механизм интернализации может управляться рецепторноопосредованными агонистами (тромбин, гистамин)[22].

Эндотелиальные клетки, стимулированные ИЛ-1, ФНОα и липополисахаридами, синтезируют Е-селектин. Для поверхностной экспрессии Е-селектина требуется около 1 часа. Адгезия нейтрофилов к эндотелию, обусловленная Е-селектином, имеет важную особенность – после исчезновения Е-селектина наблюдается локальное усиление адгезии [Carlos T.M., Harlan J. M., 1990, цит.18]. Е-селектиновая адгезия осуществляется без активации β2-интегриновой системы. Однако моноклональные антитела к β2- интегринам ингибируют адгезию нейтрофилов к цитокинактивированному эндотелию, экспрессирующему Е-селектин в различной степени в зависи-

мости от условий [Carlos T.M., Harlan J]. M., 1990, цит. 18]. Контррецепто-

ры для Р- и Е-селектинов еще недостаточно изучены, важной их частью

180