Клиническая биохимия / Кленова Н.А. Биохимия патологических состояний

других протеаз несущественна. Концентрация α2-антиплазмина в плазме может падать до 30% от нормы при тяжелых заболеваниях печени (белок синтезируется гепатоцитами), увеличение содержания данного белка совпадает с острой фазой патологического процесса (белок острой фазы). Дефицит α2-антиплазмина сопровождается кровоточивостью, так как в этом случае плазмин существует дольше установленного нормального периода его полужизни. Если это обусловлено генетической поломкой синтеза белка, кровотечение возникает при малейшей травме и даже спонтанно [31]. Показана возможность использования белка для коррекции наследственного его дефицита, что связано с достаточно выраженной консервативностью аминокислотной последовательности. Хотя α2-антиплазмин составляет всего 2,2% общей антиплазминовой активности плазмы, он имеет самое сильное сродство к плазмину и является самым сильным ингибитором фибринолиза. Решающую роль при взаимодействии плазмина с α2-антиплазмином играет активный центр плазмина, нолизин-связывающийучастокнаправляет и ускоряет их взаимодействие.

Иммуноглобулины. Белки плазмы, функционирующие как антитела, распознающие и связывающие чужеродные антигены. Поскольку каждая молекула иммуноглобулина является специфической по отношению к одной антигенной детерминанте, существует огромное множество различных иммуноглобулинов. В основе всех иммуноглобулинов лежит сходная структура, включающая две идентичные «тяжелые» полипептидные цепи и две идентичные «легкие» цепи, соединенные дисульфидными мостиками. Тяжелые цепи могут быть пяти типов (γ,α, µ, δ, ε), легкие – двух типов (λ, κ). Именно тип тяжелой цепи определяет класс иммуноглобулинов. N-терминальная аминокислотная последовательность тяжелых и легких цепей в молекулах иммуноглобулинов специфична и ответственна за распознавание антигенных детерминант (Fab-область). Аминокислотная последовательность остальных участков цепей вариабельна незначительно и содержит гомологии у каждого класса иммуноглобулинов. Этот конститутивный фрагмент участвует в активации комплемента по классическому пути и взаимодействии с иммунокомпетентными клетками. В плазме обнаруживаются иммуноглобулины следующих классов: IgG (14,0 г/л, М. 146 кДа); IgA (3,5 г/л, М.160 кДа); IgM (1,5 г/л, М.970 кДа); IgD (0,03 г/л, М. 184 кДа); IgE (следы, М.188 кДа). При электрофорезе иммуноглобулины в основном движутся с фракцией γ-глобулинов, хотя IgA и IgM могут располагаться в β- или α2-глобулинах. Полоса γ-глобулинов представлена в основном IgG, так как их количество в плазме наиболее значительно.

При рождении концентрации иммуноглобулинов А и М оказываются низкими, а затем постепенно нарастают, хотя содержание IgA может оставаться ниже, чем у взрослых, до конца первого десятилетия жизни. Иммуноглобулины G переносятся через плаценту в течение последней трети беременности, и их концентрация у новорожденных достаточно высока (за исключением недоношенных детей). Затем концентрация их снижается, так как мате-

51

ринские иммуноглобулины выводятся из организма, и происходит постепенное замещение их на собственные. Одной из причин восприимчивости новорожденных (особенно недоношенных) к инфекции является их физиологическая гипогаммаглобулинемия. Известны наследственные нарушения синтеза иммуноглобулинов, начиная с тяжелой, сцепленной с Х-хромосомой агаммаглобулинемии (болезнь Брутона), до более легкой дисгаммаглобулинемии. В тяжелой форме наблюдается развитие у детей рецидивирующих бактериальных инфекций. Наиболее часто встречается недостаточность IgA (1 из 400 детей). Приобретенная гипогаммаглобулинемия возникает при злокачественных заболеваниях крови (лейкоз, множественная миелома, болезнь Ходжкина). Гипогаммаглобулинемия может проявляться как осложнение при потере белка (нефротический синдром), при употреблении цитостатических препаратов. Повышенное содержание иммуноглобулинов выявляется как при острых, так и при хронических инфекционных заболеваниях, аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, системная красная волчанка и т.п.). Более подробно изменение белковых фракций в плазме крови будет рассмотрено в главе, анализирующей нарушения обмена веществ (белкового обмена).

Ферменты плазмы крови. Клиническая энзимология [2,17,18]. Все об-

наруживаемые в плазме крови ферменты (в норме или патологии) можно разделить на две группы: собственно ферменты плазмы (1); ферменты, попадающие в кровь из тканей или секретов (2). Первая группа больше в количественном отношении, а вторая представительнее в качественном разнообразии.

Первая группа ферментов. Сюда относятся ферменты свертывающей

ипротивосвертывающей систем крови, протеолитические ферменты и киназы, их активаторы, белки комплемента, оксидоредуктазы плазмы.

Биологическая система, сохраняющая жидкое состояние крови и предупреждающая или тормозящая кровопотери путем поддержания целостности сосудистой стенки и образования тромбов в местах повреждения сосуда получила название системы гемостаза.

Первичный или сосудисто-тромбоцитарный гемостаз обеспечивается сосудистой стенкой (микрососудами) и тромбоцитами. Ему принадлежит ведущая роль в начальной остановке кровотечения. Конечный результат – образование тромбоцитарной пробки в месте повреждения сосуда. Первичный гемостаз осуществляется эндотелием за счет его способности синтезировать

ивыделять на поверхности ингибитор простациклина; извлекать из кровотока активированные факторы свертывания. Наряду с эндотелием в первичном гемостазе участвуют тромбоциты, которые высвобождают вазоактивные вещества: серотонин, гистамин; осуществляют адгезию и агрегацию, формируя первичнуюпробку; выделяют тромбоцитарныефакторысвертывания.

Вторичный или коагуляционный гемостаз – многоэтапный ферментатив-

ный процесс, в котором участвуют ферментативные и неферментативные белки

52

плазмы и тканей, надмолекулярные образования и ионизированный кальций. Конечная цель – формирование фибринового сгустка, который повышает плотностьтромбаизакрепляетегонасосудистойстенкевместеповреждения[3].

Ферменты свертывающей системы представлены прежде всего пятью протеазами, активирующимися по каскадному механизму. Механизм включения каскада можно подразделить на внутренний и внешний.

Внутренний механизм запускается в результате контакта фактора XII (фактор Хагемана) с поврежденной поверхностью сосуда. Фактор Хагемана представляет собой одноцепочечный полипептид, активирующийся при контакте с отрицательно заряженными поверхностями за счет изменения конформации. Физиологическими активаторами служат также катехоламины, коллаген, хондроитинсерная кислота, калликреин.

Внешний механизм активируется в результате высвобождения тромбопластина из поврежденных тканей и тромбоцитов (рис. 1.3).

Активация фактора Хагемана при контакте с поврежденной поверхностью приводит к ограниченному протеолизу профермента – фактора XI и так далее по каскадному механизу до формирования тромбопластина. Весь этот процесс составляет первую фазу свертывания крови.

Из активированных тромбоцитов выделяется фермент протромбокиназа, которая вступает во взаимодействие с тремя антигемолитическими факторами плазмы: VIII, IX и X, в результате образуется тромбоцитарный тромбопластин. Тромбопластин представляет собой липопротеид, который поставляет фосфолипид, необходимый для превращения протромбина в тромбин, осуществляемого на второй стадии свертывания крови. Связыванию фосфолипида с протромбином способствуют иона кальция. Эта способность определяется увеличением числа хелатных центров связывания кальция в белке путем модификации глутаматных остатков в нескольких положениях в γ-карбоксиглутаматные. Модификация (введение дополнительных карбоксильных групп) осуществляется с помощью 1,4 нафтохинона (витамин К или антигеморрагический витамин). Превращением протромбина в активный тромбин заканчивается вторая стадия свертывания крови. На третьей стадии тромбин осуществляет ограниченный протеолиз фибриногена, превращая его в фибрин. Протромбин обозначается как II фактор свертывания крови, его содержание в плазме составляет 0,5-1,5 кЕД/л.

Первым фактором свертывания считается фибриноген, его концентрация в норме равняется 2-4 г/л (табл.1.1). Фибриноген представляет собой центральный белок системы свертывания крови. Он является субстратом для фермента свертывающей системы – тромбина. Многие заболевания сопровождаются нарушениями равновесного состояния системы свертывания, при которых в кровяном русле резко изменяется концентрация фибриногена или появляются растворимые формы фибрина.

53

ПОВРЕЖДЕНИЕ ПОВЕРХНОСТИ СОСУДА

ф.IX ф.IXa

ф.VIII

ТРОМБОЦИТЫ ф.III

ф.I (фибриноген) ф.Iа (фибринмономер)

ПДФ

Рис. 1.3. Свертываниякровиповнешнему ивнутреннему механизму активации. Непрерывныелинии– воздействие, прерывистые– превращение,

ломаная– освобождение[3]

54

Таблица 1.1

Факторы свертывания крови согласно международному Комитету по выработке номенклатуры факторов свертывания [3,42]

Возрастание количества фибриногена в плазме крови обычно свидетельствует о наличии острого воспалительного процесса. В фибриногене три пары цепей Аα, Вβ и γ образуют химический димер с М. 340 кДа. Отдельные цепи в субъединице соединены между собой дисульфидными связями. Также соединены и сами субъединицы [23]. Все три цепи фибриногена отличает высокая степень гомологии, что свидетельствует об их происхождении от одной и той же полипептидной цепи. Общее число дисуль-

55

фидных связей в молекуле фибриногена – 29. К доменам молекулы фибриногена относят центральную его часть, включающую N-концевые участки всех шести цепей (димерный домен Е) и две периферические зоны, содержащие фрагменты каждой из трех цепей (мономерные домены Д). Продуктами конечного плазминового расщепления фибриногена являются фрагменты Д и Е. Первичная структура фибриногена определяет его пространственную организацию, возможность связывания с тромбином и отщепление пептидов А и В, спонтанную полимеризацию образующегося мономерного фибрина, стабилизацию его с помощью фактора XIII и, наконец, деструкцию фибринового сгустка плазмином.

Регуляция заключительного этапа самосборки фибриновых волокон – сложный процесс, до конца еще не изученный. Известно, что фрагмент D – периферический домен фибриногена, вычленяющийся при плазминовом или трипсиновом расщеплении фибрина, способен тормозить полимеризацию, конкурируя с доменами D мономерного фибрина за центральный домен [43]. Однако в условиях физиологической нормы участие фрагмента D в регуляции самосборки фибрина проблематично, так как для его высвобождения необходим достаточно глубокий протеолиз молекулы фибриногена, осуществляющийся только при определенных условиях. В плазме крови и тканях человека обнаружен короткоцепочечный пептидный ингибитор, который образует комплексы с мономерным фибрином за счет электростатических и в малой степени гидрофобных взаимодействий, что приводит к снижению скорости полимеризации [43]. Фактор XIII – фермент из подкласса транспептидаз, катализирует образование ковалентных связей (поперечных сшивок) в фибрине, стабилизируя фибриновый сгусток.

Почему при повреждении сосуда весь протромбин не превращается в тромбин и вся кровь не свертывается? Кроме торможения самосборки фибрина существуют, во-первых, механизмы удаления активированных ферментов из каскадной последовательности, во-вторых, имеется ферментная система, растворяющая сгусток крови, – антисвертывающая система.

Центральным звеном противосвертывающей системы крови является фермент фибринолизин (плазмин), который, как и все протеазы крови, существует в двух формах: плазминоген (неактивная форма) и плазмин (активная форма). Активаторы плазминогена относят к протеазам регуляторного типа, обладающим высокой специфичностью. Хорошо изучена активация плазминогена, представляющая собой двухступенчатый процесс протеолитического расщепления одноцепочечной молекулы профермента с образованием двухцепочечной молекулы плазмина, связанной дисульфидными связями.

Активаторы плазминогена представляют собой протеазы, вызывающие расщепление аргинил-валиновых связей в молекуле белка. Первой из

56

протеаз, активирующих фибринолиз, была обнаружена стрептокиназа, фермент агрессии стрептококков. Физиологическими активаторами плазминогена являются урокиназа (впервые обнаружена в моче), тканевой ак-

тиватор, сосудистый активатор, плазменный активатор, Хагеманзависимый активатор, лизокиназозависимый активатор. Плазменные ак-

тиваторы, кроме урокиназы, включают, возможно, четыре вида активаторов, отличающихся как происхождением, так и некоторыми свойствами [1]. Тканевые активаторы прочно связаны со структурными белками мембран клеток, отличаются гомологией при выделении из разных клеток. Тканевой активатор обычно считают сериновой протеазой с М. 60 кДа, обладающей высокой стабильностью в кислой среде и термостабильностью [1,3,16]. Сосудистый активатор имеет более высокую молекулярную массу (до 80 кДа), не обладает протеолитической активностью и имеет оптимум действия при рН 8,5. Урокиназа – протеаза, имеющая как протеолитическую, так и эстеразную активность. Термостабильна, кислотоустойчива. Известно две формы: высокомолекулярная ( 47 кДа) и низкомолекулярная (33,4 кДа). Высокомолекулярная состоит из двух цепей, связанных дисульфидным мостиком, и может каталитически превращаться в низкомолекулярную (ограниченный протеолиз). Схема активации плазминогена представлена на рис. 1.4.

Тканевой активатор

Тканевые лизокиназы

Сосудистыйактиватор Активный фактор Хагемана

ИНГИБИТОРЫ

ПЛАЗМИН

Рис.1.4. Регуляция образования плазмина [3]

Таким образом, большинство активаторов плазминогена представляют собой протеазы, осуществляющие ограниченный протеолиз плазминогена. Они участвуют во многих нормальных и патологических процессах, в которых необходим экстрацеллюларный протеолиз. Важнейшие биологические свойства активаторов, обеспечивающие выполнение системой фибринолиза физиологической роли, проявляются при наличии в крови

57

фибрина. При образовании фибрина происходят связывание с ним плазминогена через лизин-связывающие участки и одновременная адсорбция активаторов, присутствующих в плазме или высвобождающихся из клеток. Образующийся под их действием плазмин остается связанным с фибрином и поэтому очень медленно инактивируется α2-антиплазмином (ингибитор плазмина). После расщепления фибрина и образования продуктов деградации фибрина (ПДФ) плазмин очень быстро инактивируется ингибитором [39]. Так как от активности активаторов плазминогена зависит фибринолитическая активность крови, их содержание в крови и тканях оказывает влияние на возникновение и течение ряда заболеваний. Нарушенное высвобождение активаторов из клеток рассматривают как фактор риска в развитии тромбоэмболий и атеросклероза [24]. Снижение содержания активаторов плазминогена регистрируется в сосудах, закрытых тромбозом.

Продукты плазминовой деградации фибриногена и фибрина проявляют антикоагуляционную активность, причем у продуктов расщепления фибрина она выражена более слабо. Установлено также ингибирующее влияние ПДФ, в частности фракции Е, на образование тромбопластина [39]. Антикоагуляционное действие ПДФ можно объяснить подавлением полимеризации фибрин-мономера, так так фрагменты белка образуют с фибрин-мономером высокомолекулярные комплексы, что и замедляет полимеризацию. Этот механизм, а также непосредственное включение ПДФ в сетку фибрина приводят к образованию «дефектного» сгустка с пониженной механической прочностью. ПДФ оказывают влияние и на функцию тромбоцитов, снижая их способность к агрегации, адгезии и вязкому метаморфозу [39].

К основным наследственным нарушениям системы свертывания крови относится гемофилический синдром (отсутствие или нарушение фактора VIII (гемофилия А). Болезнь связана с замедлением образования тромбопластина. Наследуется по рецессивному сцепленному с полом типу. Другие (более редкие) заболевания: гемофилия В (недостаток фактора IX); болезнь Провера-Стюарта (недостаток фактора Х); болезнь Хагемана (нарушение ХII фактора); болезнь Розенталя (нарушение фактора ХI) и т.п.

Наследственная а-(гипо)фибриногенемия проявляется умеренной кровоточивостью, удлинением времени кровотечения после травм, носовыми и десневыми кровотечениями, плохим заживлением ран. При дисфибриногенемиях (молекулярные аномалии фибриногена) наблюдаются синяки при малейших ушибах, небольшая кровоточивость при травмах. Часто протекает бессимптомно.

Есть также ряд заболеваний, характеризующихся кровоточивостью, обусловленных тромбоцитарной недостаточностью. Рассмотрим ряд патологий, в основе которых лежит уменьшение числа тромбоцитов или их неполноценность [3]. К группе заболеваний, обозначенных как тромбоцитопении, относят состояния ускоренного разрушения или недостаточного об-

58

разования тромбоцитов, исключая те из них, которые связаны с наследственным дефектом метаболизма, приводящим к тромбоцитопении.

Аутоиммунная тромбоцитопения характеризуется значительным укорочением продолжительности жизни клеток (2-4 часа вместо 7-10 дней)

иускоренным производством в 2-6 раз от нормы. При наследственных формах укорочение продолжительности жизни обусловлено энзимопатией гликолиза или цикла Кребса, при иммунных – появлением антитромбоцитарных или антимегакариоцитарных антител. Основными клиническими проявлениями служат гемотомы на передней поверхности конечностей

итуловища, кровоизлияния в местах инъекций, высыпания. Реже – желу- дочно-кишечные кровотечения, гематурия, длительные кровотечения после травм. Изменения лабораторных показателей выражаются в значительном снижении числа тромбоцитов (иногда полном их отсутствии), увеличении размеров тромбоцитов, появлении мелкозернистых клеток, пойкилоцитозе. Время кровотечения удлинено, уменьшено время ретракции сгустка. Свертываемость крови и показатели аутокоагуляционного теста не изменены (табл. 1.2).

Таблица 1.2

Показатели антикоагуляционного гемостаза [3]

Однако еще большую опасность (так как чаще приобретаются в процессе жизни, а не обусловлены наследственными поломками) представляют процессы гиперкоагуляции, играющие весьма важную роль в генезе заболеваний сердца и сосудов. Факторы, способствующие гиперкоагуляции, это высокое артериальное давление, повышенная иммунизация, атеросклероз, изменения в системе фибринолиза. Обычно наблюдается снижение процессов активации плазминогена (биохимические причины полностью

59

пока невыяснены), уменьшение количества плазмина, что приводит к увеличению содержания фибрина, а его пристеночное отложение внутри сосудов – к формированию бляшек и тромбов.

Наиболее часто наблюдается синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания – ДВС-синдром, который представляет собой об-

щепатологический процесс, вызванный проникновением в кровоток активаторов свертывания крови и агрегации тромбоцитов. Это ведет к тромбинемии, активации и истощению свертывающего, калликреин-кининового, фибринолитического потенциалов, к развитию микротромбозов, геморрагий, сопровождаемых состояниями гипоксии и ацидоза, интоксикации продуктами распада белков и других соединений. Ключевое звено в ДВСсиндроме – тромбинемия различной этиологии. Провокационные факторы разнообразны: инфекция, шок, тяжелые травмы, ожоги, острый внутрисосудистый гемолиз, деструкция тканей, иммунные заболевания и аллергические реакции, лекарства, вызывающие агрегацию и активацию тромбоцитов, антикоагулянты и фибринолитики. Течение процесса может быть острым или затяжным, рецидивирующим, хроническим и латентным.

К белкам собственно плазмы крови относятся также белки системы комплемента, которые подробно рассмотрены выше и система оксидоредуктаз, обеспечивающая необходимый транспорт электронов, нейтрализующая (в какой-то мере) активные формы кислорода. Некоторые из них играют роль аккумуляторов активных двухвалентных катионов. Рассмотрим наиболее важные оксидоредуктазы плазмы крови. Церулоплазмин представляет собой медьсодержащую оксидоредуктазу. Выполняет роль транспортирующего и аккумулирующего медь компонента фракции α-глобулинов. Проявляет оксидазную активность в присутствии некоторых субстратов, например, п-фенилендиамина. Молекулярная масса составляет 151 кДа, содержит 8 атомов меди на одну молекулу, четыре атома в виде Cu+, четыре могут переходить из Cu+ в Cu2+. Чистый белок имеет интенсивно голубую окраску. Церулоплазмин – неспецифическая оксидаза, может окислять различные полиалкоголи, гидрохиноны, катехолы. Оптимум рН составляет 5,6-6,0, ингибируется цианидами и азидами, активируется Fe2+. Биохимическое название фермента – орто-дифенилоксидаза (К.Ф. 1.10.3.1), общая реакция, катализируемая церулоплазмином, выглядит следующим образом:

Ортофенол + О2 → ортохинон + 2Н2О Церулоплазмин

Может окислять монохиноны и аскорбиновую кислоту. Содержание фермента в плазме около 3 мг/л, почти вся медь плазмы аккумулирована в этом белке. Физиологическая роль как фермента остается неясной, так как неизвестны естественные субстраты плазмы и нет доказательств, что

60