Методы идентификации нуклеиновых кислот

Методы выявления ДНК и РНК-возбудителей в настоящее время применяют в основном для диагностики вирусных инфекций. Методы генной диагностики базируются на выявлении нуклеотидных последовательностей непосредственно в патологическом материале с помощью молекулярных зондов — искусственно полученных нуклеиновых кислот, комплементарных вирусным нуклеиновым кислотам и меченных биотином или радиоактивной меткой.

Особенность метода ПЦР — многократное копирование (амплификация, репликация) с помощью фермента ДНКполимеразы определённого фрагмента ДНК, состоящего из нескольких десятков или сотен нуклеотидных пар, который уникален, то есть специфичен для данного вида вирусавозбудителя. Механизм репликации таков, что достраивание фрагмента может начаться только в определённых стартовых блоках, для создания которых в заданных участках ДНК используют затравки (праймеры) — специально синтезированные олигонуклеотиды. Праймеры комплементарны последовательностям в пределах границ специфического фрагмента, и синтез ДНК протекает только в этих границах.

Процесс ПЦР заключается в большом числе циклов синтеза (амплификации) специфического фрагмента ДНК, накоплении большого числа копий, которые затем могут быть выявлены обычными методами детекции (иммунофлюоресцентный анализ, электрофорез).

Преимущества ПЦРдиагностики:

●простота исполнения; ●возможность полной автоматизации; ●быстрота получения результата; ●малое количество патологического материала, необходимого для исследования; ●возможность диагностики острых, хронических, латентных инфекций; ●выявление некультивируемых, персистирующих форм патогенов.

По чувствительности ПЦР наиболее совершенен как диагностический метод (на несколько порядков выше, чем другие тесты). Специфичность метода также высока, но пока большинство тестсистем недостаточно надёжны, чтобы вытеснить классические методики при диагностике даже абсолютных патогенов.

Что касается оппортунистических инфекций, то значение молекулярно-генетических методов диагностики пока нельзяпризнать сколько-нибудь значимыми, так как определяющим моментом в развитии таких воспалительных процессов служит количественный фактор, а не само по себе присутствие микроорганизма в обследуемом локусе.

В настоящее время ПЦР-методы широко используют в диагностике вирусных, паразитарных и бактериальных ИППП, чаще в качестве первичного скрининга, а также контроля излеченности в сочетании с другими методами лабораторной диагностики. С помощью новейших технологий, таких как ПЦР в режиме реального времени и метода NASBA, можно определить точное количество вируса у ВИЧпациентов.

Серологические методы диагностики

Методы, выявляющие специфические АТ и Аг возбудителей. Важна их роль особенно в тех случаях, когда выделение возбудителя представляет значительные трудности. При выявлении специфических АТ необходимо установить повышение их титров, в связи с чем исследуют парные сыворотки с интервалом 2–3 нед. Определение классов иммуноглобулинов чётко характеризует этапы инфекционного процесса и в ряде случаев может служить прогностическим признаком его течения.

Большое значение имеют методы выявления Аг возбудителей. Их можно обнаружить уже на самых ранних этапах инфекционного процесса, что делает возможной экспрессдиагностику, а количественное определения Аг в динамике заболевания служит критерием эффективности проводимого лечения.

Ведущее значение приобрели серологические методы в диагностике сифилиса и ВИЧинфекции. В диагностике ВИЧинфекции обычно используют иммуноферментный анализ, позволяющий получить положительные результаты исследования уже через 1–1,5 мес после заражения. Положительные результаты скрининга с использованием иммуноферментного анализа требуют подтверждения методом иммуноблота, который позволяет верифицировать АТ к различным вирусным белкам.

При диагностике сифилиса в настоящее время используют разнообразные серологические методы, позволяющие выявлять в организме АТ к различным Аг детерминантам T. pallidum. В зависимости от используемого Аг серологические реакции делят на две группы: трепонемные и нетрепонемные. Первые используют для скрининга. Они технически просты в исполнении, не требуют много времени, возможен количественный вариант реакции с определением титра АТ, что позволяет использовать их для оценки эффективности проводимого лечения. Однако эти тесты не позволяют обнаружить АТ в первые 2–4 нед первичного сифилиса, а также возможны ложноположительные и ложноотрицательные реакции.

Трепонемные тесты обладают высокой специфичностью и позволяют подтвердить результаты нетрепонемных тестов. Но трепонемные тесты оказались недостоверными при исследовании спинномозговой жидкости (кроме реакции прямой гемагглютинации), их также не используют в качестве контроля эффективности лечения и не исключена возможность ложноположительных реакций.

При оппортунистических бактериальных инфекциях, возбудители которых имеют много общих Аг с тканевыми Аг организма хозяина и служат слабыми стимуляторами выработки специфических АТ, серологические методы диагностики практически не используют.