Метод оценки функциональной активности лейкоцитов крови с помощью хемилюминесценции

СИНОНИМЫ

Оценка продукции активных форм кислорода фагоцитирующими клетками крови.

ОБОСНОВАНИЕ

Центральное место в антимикробной активности фагоцитирующих клеток периферической крови занимает кислородный, или респираторный, «взрыв», вследствие чего генерируются активные формы кислорода в системе НАДФНоксидазы. В оценке кислородного «взрыва» наиболее широко используют методы измерения генерируемых во внеклеточную среду супероксидного аниона или перекиси водорода по их способности окислять соответствующий субстрат (люцигенин или люминол) в люминесцирующий метаболит.

ЦЕЛЬ

Оценка спонтанной и индуцированной продукции активных форм кислорода лейкоцитами крови.

ПОКАЗАНИЯ

Метод эффективен для оценки функционального состояния фагоцитов периферической крови (гранулоцитов и моноцитов), его используют для прогнозирования тяжести заболевания и контроля эффективности терапии при воспалительных процессах.

ПОДГОТОВКА

Кровь, взятую из вены в пробирки с гепарином (2 Ед/мл), разводят раствором Хенкса без кальция в пропорции 1:1, сохраняют в течение 1 ч при 4 °С.

МЕТОДИКА

Продукцию активных форм кислорода оценивают по люминолзависимой хемилюминесценции с помощью хемилюминометра. Разведённую кровь добавляют в ячейки для измерений, содержащие среду Хенкса с добавлением 1 мМ кальция и раствор люминола. Проводят измерение спонтанной хемилюминесценции и хемилюминесценции, активированной опсонизированным зимозаном. Результаты измерения регистрируют непрерывно в виде кинетической кривой. Интенсивность хемилюминесцентного ответа оценивают по максимальному значению на кинетической кривой.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

В результате анализа получают показатели спонтанной и индуцированной хемилюминесценции, рассчитывают индекс активации (отношение индуцированной к спонтанной реакции), сопоставляют их с нормативными показателями. Чувствительность и специфичность зависят от качества используемых реагентов.

ФАКТОР, ВЛИЯЮЩИЙ НА РЕЗУЛЬТАТ

На результат влияет длительность интервала времени, прошедшего с момента взятия крови. Исследование проводят не позднее чем через 4 ч после взятия крови.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

• Применение теста восстановления нитросинего тетразолия.

• Оценка активных форм кислорода методом проточной цитометрии.

Оценка интерферонового статуса

ОБОСНОВАНИЕ

ИФН — биологически активные белки или гликопротеиды, синтезируемые клеткой в процессе защитной реакции на чужеродные Аг, представляют собой первую линию защиты против вирусов, принимают участие в стимуляции фагоцитоза, усиливают естественную цитотоксическую активность, оказывают антипролиферативное действие на нормальные и опухолевые клетки. Определение интерферонового статуса — один из тестов оценки иммунореактивности организма.

ЦЕЛЬ

Определение содержания общей фракции сывороточных ИФН, уровня спонтанной и индуцированной in vitro продукции

ИФНα и ИФНγ.

ПОКАЗАНИЯ

Метод используют для оценки функционального состояния лейкоцитов периферической крови, применяют для прогнозирования тяжести заболевания и для контроля эффективности терапии при острых и хронических вирусных инфекциях, аллергических и аутоиммунных заболеваниях, при разработке индивидуальных схем лечения препаратами ИФН и его индукторами.

ПОДГОТОВКА

Взятие венозной крови стерильным одноразовым шприцем в объёме 2 мл в стерильную пробирку с крышкой, содержащую гепарин (2 Ед/мл).

МЕТОДИКА

Тестирование проводят в стерильных 96луночных круглодонных планшетах в трёх повторах. Клетки инкубируют при 37 °С без индукторов, с вирусом болезни Ньюкасла для индукции ИФНα, с фитогемагглютинином Р для индукции ИФНγ. Оставшуюся кровь центрифугируют и используют для определения сывороточного ИФН. Титрование ИФН проводят в 96луночных плоскодонных планшетах с диплоидной культурой фибробластов человека М19. В качестве тествируса используют вирус мышиного энцефаломиокардита. За единицу активности ИФН принимают величину, обратную его разведению, задерживающую деструкцию монослоя клеток на 50% (Е/мл).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Повышение титров сывороточного ИФН может свидетельствовать об острой стадии заболевания. Существует прямая связь между показателями ИФНα и ИФНγ и тяжестью заболевания, а также обратная связь с количеством сывороточного ИФН. Снижение продукции ИФНα и ИФНγ указывает на дефект системы ИФН (врождённый или приобретённый); это показание для ИФНстимулирующей терапии.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ

• Продолжительность интервала времени, прошедшего с момента взятия крови (не более 4 ч).

• Нарушение стерильности.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

• Иммуноферментный метод.

• Внутриклеточное окрашивание цитокинов в стимулированных клетках, регистрация результатов с помощью проточной цитофлюориметрии.