Направление «Медицина»

Белоногова Н.В.

«Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Изменение физиолого-биохимических характеристик Staphylococcus aureus при действии стрессоров различной природы

Золотистый стафилококк часто входит в состав нормальной микрофлоры человека. Подавляющее число стафилококковых инфекций носит эндогенный характер, связанный с активацией аутомикрофлоры. Этот факт подчеркивает безусловную важность исследований, связанных с возможностью направленной регуляции интенсивности жизнедеятельности такого рода бактерий [1].

Активация аутомикрофлоры может происходить вследствие ослабления иммунитета, а также при различных стрессовых воздействиях окружающей среды. Таким образом, важным аспектом в исследовании физиологии золотистого стафилококка является изучение его реакций на различные стрессоры [2].

В связи с этим целью настоящей работы явилось оценить изменения физиологических и биохимических характеристик Staphylococcus aureus при действии биологических, химических и физических стрессоров.

В ходе работы решались следующие задачи:

5. Выявить стресс-индуцированные морфологические изменения Staphylococcus aureus при действии стрессоров различной природы.

6. Оценить изменение ферментативной активности Staphylococcus aureus при стрессе.

7. Охарактеризовать развитие стафилококковой инфекции у мышей, вызванной штаммом S. aureus, обработанным ацилированным гомосеринлактоном.

8. Оценить возможность индукции сигнальных молекул клетками S. aureus при действии стрессоров.

Ацилированные лактоны гомосерина (АГЛ) являются сигнальными молекулами плотностно-зависимых процессов у грамотрицательных бактерий. По данным литературы грамположительные бактерии, в частности золотистый стафилококк, способны реагировать на экзогенный гомосеринлактон (ГСЛ) [3]. В связи с этим в качестве условно биологического стрессора был выбран ацилированный гомосеринлактон (N-гексаноил-DL-гомосеринлактон, М.в.=199,25).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что микробный сигнальный агент гомосеринлактон не проявляет токсических и генотоксических эффектов в диапазоне концентраций от 1 до 1000 мкг/мл по отношению как к про-, так и к эукариотам. Также было показано, что ГСЛ не влияет на морфологию колоний стафилококка и на переход клеток стафилококка в гипометаболическое и некультивируемое состояние в процессе длительного инкубирования культуры.

Основываясь на этих данных, мы оценили возможность синергетических эффектов АГЛ в отношении клеток стафилококка при действии теплового шока. Было показано, что воздействие теплового шока (ТШ) 45°С на культуру S. aureus после ее предварительной обработки ГСЛ вызывает более раннее наступление стационарной фазы роста культуры, что, вероятно, связано с накоплением токсичных метаболитов.

Также нами было показано, что двухчасовая предобработка стафилококка гомосеринлактоном перед ТШ не влияет на лецитиназную активность, но приводит к повышению устойчивости протеаз к тепловому шоку 60°С и к повышению чувствительности гемолизинов к действию ТШ, за счет чего ингибируется гемолитическая активность.

Кроме того, мы определяли участие ГСЛ в развитии стафилококковой инфекции у мышей in vivo. Процент выживаемости мышей, зараженных необработанным ГСЛ стафилококком, в 2-3 раза ниже процента выживаемости мышей, зараженных стафилококком, прошедшим двухчасовую предобработку ацилированным гомосеринлактоном.

Методом масс-спектрометрии показано достоверное увеличение концентрации железа (в 35 раз) и кремния (в 2 раза) в крови больных мышей по сравнению со здоровыми. Установлено, что печень зараженных мышей содержит в 2 раза больше калия, чем печень здоровых мышей. Поэтому очень важно отметить, что количественное содержание исследованных катионов для мышей, зараженных культурой стафилококка, обработанной ацилированным гомосеринлактоном, значимо не отличалось от контроля.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать главное предположение о том, что предварительная обработка стафилококка ацилированным гомосеринлактоном приводит к снижению вирулентности что в первую очередь видно по подавлению выработки гемолизинов, которые являются одним из основных факторов патогенности стафилококка.

Одним из новых направлений в регуляции кворум-эффектов у микроорганизмов является использование искусственно синтезированных химических агентов – фуранонов. Мы в своей работе использовали галогенированные фураноны [4]. По своей химической природе они являются аналогами ГСЛ, способными регулировать плотностно-зависимые процессы у бактерий.

Было определено влияние Фуранона 1 (5-гидрокси-4-(4-метилфенилсульфонил)-3-хлор-2(5Н)-фуранона) в различных концентрациях на стафилококк при ТШ. В варианте Фуранон 1 в концентрации 10 мкг/мл при ТШ 45ºС отмечалось снижение числа колониеобразующих единиц (КОЕ) в 2 раза. В варианте фуранон 1 в концентрации 1 мкг/мл при ТШ 45ºС на желточно-солевом агаре (ЖСА) на 72 час роста появились мелкие круглые колонии стафилококка без лецитиназной активности, составившие 80% от всех колоний.

При высеве культуры стафилококка на агаризованные среды, в которые предварительно был внесен фуранон 1 в исследуемых концентрациях, отмечали небольшую стимуляцию роста в вариантах 1 и 20 мкг/мл, изменение ферментативной активности не наблюдали.

При росте стафилококка на жидкой среде, содержащей фуранон 1 в концентрациях 1, 10 и 20 мкг/мл, оптическая плотность культуры и общее число клеток на 24 час роста не отличалось от контрольного варианта (без вещества). Но в вариантах, содержащих фуранон, наблюдали снижение числа КОЕ примерно в 2 раза по сравнению с контролем. В варианте фуранон 1 в концентрации 1 мкг/мл 17 % колоний имели отличную морфологию. Это были большие кремовые колонии с неровным краем.

Таким образом, фуранон 1, в отличие от АГЛ, при совместном действии с ТШ 45°С снижает лецитиназную активность стафилококка, а также приводит к появлению новых морфотипов колоний и снижает способность к колониеобразованию при инкубировании культуры в жидкой среде в его присутствии.

В качестве физического стрессора нами было выбрано рентгеновское излучение. Воздействие рентгеновским излучением на собственную микрофлору человека потенциально может спровоцировать ее активацию.

Был проведен эксперимент по обработке S. aureus в трех различных режимах на аппарате рентгенокомпьютерной томографии (РКТ) и в шести различных режимах на рентгеновских аппаратах в РКБ. В качестве контроля использовали необработанную культуру.

Наблюдали снижение числа КОЕ в образцах подвергшихся обработке в 1.5-2.5 раз, изменение ферментативных активностей по сравнению с контролем не наблюдали.

Различные дозы рентгеновского облучения приводят к стимуляции роста культуры, о чем можно судить по увеличению числа КОЕ. По этим данным можно предположить, что данные дозы облучения являются стрессом средней силы, активирующим жизненные силы организма. В некоторых вариантах отмечалось снижение гемолитической и протеолитической активности.

По данным литературы стафилококк не способен вырабатывать собственный ГСЛ, поэтому наши предыдущие эксперименты оценивали влияние экзогенно внесенного ГСЛ на стафилококк. Но хроматографический анализ образцов, подвергшихся рентгеновскому облучению, показал наличие АГЛ в образцах. Таким образом было показано, что данный стрессор индуцирует синтез собственных ГСЛ или их гомологичных структур. Что является принципиально новыми данными.

Заключение: Исходя из всех полученных данных каждый вид стрессоров вызывает свои реакции у стафилококка: ГСЛ снижает вирулентность, фуранон 1 снижает способность к колониеобразованию и изменяет морфологию колоний, ренгеновское облучение индуцирует синтез ГСЛ. Общим для всех этих стрессоров является изменение у стафилококка той или иной ферментативной активности.Все перечисленные эффекты в свою очередь можно рассмотреть как промежуточные этапы перехода клеток стафилококка в гипометаболическое состояние.

Борханова Э.Г.

«Казанский государственный медицинский университет»