Протеиназа htra из bacillus subtilis 168, как потенциальный ранозаживляющий агент

Одной из актуальных задач в современной медицине является создание перевязочных средств, снижающих гноеобразование и омертвение тканей. Одним из подходов к решению этой задачи является использование протеиназных комплексов – ферментов, разлагающих белки. Хорошо известно, что протеиназы, расщепляя денатурированные белки, способствуют очищению ран, и следовательно, ускорению их заживления. Научная новизна работы определяется тем, что впервые в качестве ранозаживляющего препарата будет предложена температуро-зависимая протеиназа, обладающая специфичностью к поврежденным белкам. Использование данного фермента в качестве ранозаживляющего агента потенциально позволит получить низкую токсичность препарата за счет специфичности к денатурированным белкам, а также позволит получить препарат, проявляющий максимум активности при повышенных температурах, наблюдаемых при воспалительных процессах.

Для исследования свойств белка было необходимо получить штамм, обеспечивающий гиперпродукцию рекомбинантного белка HtrA со стреп-тагом на С-конце белка. Фрагмент ДНК, несущий ген htrA размером 1400 п.о., получали с помощью ПЦР с геномной ДНК B.subtilis 168, после чего клонировали в экспрессионный вектор pDG148. В плазмиде ген встроился таким образом, что встал под контроль SPAC-промотора и lac-оператора. Полученную плазмиду (далее pDG148-htrA), для её препаративной наработки, трансформировали в штамм E.coli XL1 Blue, а рекомбинатные штаммы затем отбирали на селективной среде с антибиотиком. Наличие и направление вставки гена проверяли с помощью ПЦР.

Для гиперпродукции белка HtrA, плазмиду pDG148-htrA трансформировали в штамм E.coli BL21, после чего отбирали колонии на среде с ампициллином. С 12 случайных колоний проводили скрининг на гиперпродукцию белка HtrA. Однопроцентную ночную культуру клеток инкубировали при 25ºС. По достижении культурой ОП₅₉₀=0.8, индуцировали экспрессию целевого белка внесением ИПТГ до конечной концентрации 0,4 мМ. Количество белка анализировали с помощью SDS-ПААГ электрофореза.

Очистку рекомбинантного белка HtrA проводили на стреп-тактин сефарозе. В колонку с сорбентом заливали клеточный экстракт E.coli BL-21 pDG148-htrA. Белок HtrA, имеющий стреп-таг на С-конце, афинно связывался со стреп-тактином, что позволило разделить целевой белок от общей фракции.

Определение протеолитической активности проводили на хромогенном субстрате азоказеине (Fluka) in vitro. Максимум активности очищенной протеиназы наблюдался при рН Tris-HCl–буфера 7,0 и температуре 32°C, как видно на рисунке:

В

Б

А

где, А – условия в фосфатном буфере при t=37°C. Б – условия в TrisHCl буфере при t=37°C. В – при различных температурах, и при рН=7,0.

Ввиду того, что уровень очистки белка HtrA с помощью стреп-тага не обеспечил ожидаемого уровня, было принято решение о модификации белка гистидиновым тагом с N-конца белка. ПЦР продукт гена htrA заклонировали в вектор pJET1.2/blunt. При замыкании данного вектора самого на себя активируется летальный для клетки-реципиента ген, что облегчает селекцию рекомбинантных плазмид. Дополнительным селективным фактором выступает среда с антибиотиком, на которой происходит высевание клеток после трансформации.

Протеиназа HtrA имеет два функциональных домена, один из которых - трипсиновый, выполняет протеолитическую функцию, в то время как PDZ-домен играет роль регулятора протеолитической активности. Интересно проверить значение PDZ-домена для функциональности белка и провести очистку белка HtrA, с делецией вышеупомянутого домена. Ген htrA, длиной 1400 п.о., лишенного кодирующей части в 400 п.о. регуляторного участка белка обозначили, как htrS (short), в конечном итоге имеющего размер около 1000 п.о.. ПЦР продукт данного гена также был заклонирован в вектор pJET1.2/blunt.

Полученные рекомбинантные вектора далее были трансформированы в клетки E.coli XL1 Blue для дальнейшей возможности нарабатывать плазмиду в препаративном количестве. Целевые гены вырезались из плазмиды по сайтам рестрикции BamH1 и далее клонировались в другой экспрессионный вектор pET15, имеющего закодированный гистидновый таг для афинной хроматографии белков HtrA и HtrS на Ni-NTAколонке. Полученные вектора далее были трансформированы в клетки E.coli Top10. Колонии, прошедшие селекцию на среде с антибиотиком были проверены на наличие рекомбинантных плазмид.

Далее будет проводиться очистка белка HtrA и рекомбинантного белка с делецией PDZ-домена, получившего условное название HtrS, на Ni-NTA сефарозе и будет дана сравнительная характеристика их физико-химических свойств. При условии, что протеолитическая активность белков окажется приемлемой для использования в энзимотерапии, далее будет проведена иммобилизация ферментов с последующими клиническими испытаниями.