Влияние 4-холестен-3-она на экзоцитоз везикул рециклирующего и резервного пулов

В мозге образуются разнообразные оксистеролы, часть из них имеет выраженные эффекты на экспрессию генов и метаболизм нейронов. Воздействия оксистеролов на синаптическую передачу практически не изучены. В нервном окончании синаптические везикулы разделяются на популяции: меньшая часть везикул, обеспечивающая синаптическую передачу при низкочастотной активности или вначале высокочастотной стимуляции, относится к рециклирующему пулу, а большая часть везикул, вовлекающаяся в экзоцитоз только в условиях продолжительной высокочастотной активности - к резервному пулу. В нашей работе мы исследовали с помощью флуоресцентного метода влияние окисленного варианта холестерина (4-холестен-3-она, 200 нМ) на экзоцитоз синаптических везикул, принадлежащих к рециклирующему и резервному пулам в нервно-мышечном синапсе лягушки. Для слежения за экзоцитозом использовали краситель - FM1-43, который обратимо связывается с пресинаптической мембраной и во время эндоцитоза оказываются внутри вновь образующихся синаптических везикул. Оказалось, что обработка 4-холестен-3-оном существенно ускоряет вызванное стимуляцией 20 Гц снижение флуоресценции («выгрузки») в нервных окончаниях, где красителем FM1-43 предварительно загружены резервный и рециклирующие пулы везикул. При этом особенно выраженное ускорение выгрузки FM1-43 наблюдается в период, начиная с 30 с высокочастотной (20 Гц) стимуляции. В данный период в экзоцитоз вовлекаются везикулы резервного пула. Если с помощью кратковременной (20с) стимуляции с частотой 20 Гц избирательно загружать FM1-43 в везикулы рециклирующего пула, то последующая выгрузка FM1-43 в ходе низкочастотной стимуляции (2 Гц) на фоне действия 4-холестен-3-она происходит лишь немного быстрее, чем в контроле. Это говорит о слабом влиянии данного оксистерола на экзоцитоз везикул рециклирующего пула. Таким образом, 4-холестен-3-он способствует экзоцитозу синаптических везикул, преимущественно относящихся к резервному пулу.

Игтисамова Г. Р.

«Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Участие глутатиона в снятии токсического действия 2,4,6-тринитротолуола

Токсический эффект 2,4,6-тринитротолуола (ТНТ) трудноразлагаемого нитроароматического соединения связан не только с присутствием в среде культивирования ксенобиотика и (или) продуктов его микробной трансформации, но и с внеклеточной аккумуляцией активных форм кислорода (АФК), образующихся на первом этапе его трансформации. [1, с. 350-357; 2, с. 463-469]. В связи с этим очевидно, что одним из подходов к снижению токсических свойств ксенобиотика является использование соединений, обладающих антиоксидантными свойствами. Одним из таких соединений является глутатион.

Глутатион является одним из важнейших веществ, определяющих защиту клеток от окислительного стресса. Он участвует в синтезе высокоактивных липидных веществ, называемых лейкотриены, и является  кофактором  фермента глутатионпероксидазы. Глутатион также играет важную роль в выведении токсических веществ из организма. В качестве гидрофильной молекулы, он присоединяется ферментами печени к гидрофобным токсическим веществам в процессе их  биотрансформации и в составе  желчи выводит их из организма. Как часть глиоксалазной ферментативной системы глутатион участвует в реакции детоксификации метилглиоксаля, токсического побочного продукта метаболизма. Глиоксалаза I превращает метилглиоксаль и восстановленный глутатион в лактоилглутатион. Глиоксалаза II гидролизует лактоилглутатион на глутатион и лактат (молочную кислоту). Глутатион не только защищает клетку от таких токсичных агентов как свободные радикалы, но и в целом определяет редокс-статус внутриклеточной среды.

Настоящая работа посвящена оценки роли глутатиона в снятии токсического эффекта 2,4,6-тринитротолуола (200 мг/л) в отношении штамма Escherichia coli.

В работе использовались штаммы JTG 10 и AB 1157, которые были предоставлены пермским институтом экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Глутатион в концентрации 270 мг/л вносили после автоклавирования. О концентрации биомассы судили по оптической плотности при 670 нм на фотометре КФК2УХЛ4.2. и общему количеству клеток. Общее количество клеток в микробной суспензии определяли, пользуясь счетной камерой Тома – Горяева. Эффективность трансформации ТНТ оценивали по убыванию концентрации ТНТ в культуральной жидкости. Для определения ТНТ использовали метод, основанный на цветной реакции ТНТ с Na₂SO₃ в щелочных условиях.

Гранулярность клеток E. сoli определяли с помощью проточной цитометрии. Для проведения анализа пробы предварительно отмывали 0.5% NaCl и суспендированный осадок помещали в пробирки для цитометрии. Измерения проводились на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (Becton Dickinson, USA) при возбуждении лазером с длиной волны 488 нм со скоростью не более 1000 клеток/сек. Измеряли боковое светорассеяние SSC (показатель гранулярности) без предварительного окрашивания клеток. Гранулярность клеток выражали в условных единицах светорассеяния (флюоресценции). В каждом варианте опыта записывали не менее 30000 клеточных событий. Результаты анализировали на рабочей станции Macintosh Quadra 650 в программе Cell Quest (Becton Dickinson) с применением статистики Колмогорова-Смирнова. Математическую обработку данных проводили в стандартной компьютерной программе “ Excel 7.0.”

На первом этапе работы мы оценили влияние восстановленного глутатиона, внесенного в среду культивирования, на изменение гранулярности исследуемых штаммов на синтетической среде М9. Наблюдалось снижение гранулярности, что говорит о детоксикации ТНТ глутатионом.

Оценка влияния восстановленного глутатиона на элиминацию ТНТ (200 мг/л) штаммов Escherichia coli показала, что восстановленный глутатион не оказывает влияния на процесс элиминации 2,4,6-тринитротолуола Escherichia coli АВ 1157 и увеличивает удельную скорость элиминации ксенобиотика Escherichia coli JTG 10, иными словами, наблюдается снижение токсического действия ТНТ в отношении штамма JTG 10.

В связи с вышеперечисленным, очевидно, что изучение вклада восстановленного глутатиона в антиоксидантную защиту и редокс-регуляцию ответов на стрессы, а также выяснение иных функций глутатиона у прокариот является важной проблемой, требующей дальнейших исследований.

Илюхина Д.Л.­­­

«Казанский (Приволжский) федеральный университет»