Влияние гомоцистеина на активность кальций – активируемых калиевых каналов (вк-каналов) в gh3 клетках гипофиза крысы.

Гомоцистеин (Нсу) – серосодержащая аминокислота, производное метаболизма метионина, относится к эндогенным тиолам. Изменения концентраций эндогенных тиолов могут приводить к нарушениям во многих системах организма, в том числе, сердечно-сосудистой, нервной, патологиям развития нервной системы, нейродегенеративным заболеваниям. В частности, наследственное или приобретенное повышение уровня гомоцистеина – гомоцистеинемия - является причиной ряда патологий нервной системы как в развивающемся, так и взрослом мозге, что указывает на нарушения процессов нейрональной пластичности.

Механизмы развития болезней, вызванных нарушением баланса тиолсодержащих агентов, не до конца изучены. Поэтому исследование эффектов и механизмов действия различных тиолсодержащих агентов на функционирование нервной системы является актуальной проблемой нейрофизиологии, так как позволит определить механизмы, лежащие в основе их нейротоксического и нейропротекторного влияния на процессы синаптической пластичности в онтогенезе и в условиях возникновения хронической боли.

Кальций-активируемые калиевые каналы (BK-каналы) играют ключевую роль в регуляции возбудимости многих тканей, вовлечены во множество клеточных функций и играют существенную роль в управлении электрической деятельностью клеток [4, с. 389-397], гормональной секреции, и вазорегуляции. В связи с этим, целью данной работы явилось исследование влияния Нсу на выходящие К-токи и на активность ВК-каналов в клетках GH₃ гипофиза крысы.

Эксперименты проводились на культуре гипофизарных клеток крысы GH3, полученных из коллекции микроорганизмов и клеточных культур ФРГ. GH3 клетки - клеточная линия нейросекреторных клеток, происходящая из переднего гипофиза, и обладающая спонтанной активностью. Клетки культивировались при температуре 37^oC и влажности 90% в растворе MEM (Minimal Essential Medium), дополненным 7% FCS (fetal calf serum) и 3% HS (horse serum). Для экспериментов клетки растили в чашках Петри на покровных стеклах, покрытых поли-D-лизином. Регистрацию электрических ответов проводили на 3-4 дни после высаживания. Пэтч-пипетки изготавливались из боросиликатного стекла (Havard Apparatus) и имели сопротивление 5-8 MOм. Регистрация токов в режиме whole cell или outside out проводилась с использованием усилителя Axopatch-200B с использованием программы Clamp10 (Axon Instruments/Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). В экспериментах использовались следующие растворы: стандартный внеклеточный раствор (мМ): NaCl 145; KCl 5; MgCl2 1; CaCl2 1; HEPES 10; внутрипипеточный раствор (мМ): KCl 145; MgCl2 1; CaCl2 3,63 (что соответствует 0.5 мкМ свободного Ca²⁺); HEPES 10; EGTA 1; АТФ 1. Кроме того, в ряде экспериментов в пипеточный раствор добавлялся NADH в концентрации 100 мкМ.

Ионные токи вызывались в ответ на серии деполяризующих импульсов от -60 мВ до +100 мВ с шагом в 20 мВ. Для экспериментов брали Нсу в концентрации 100 и 300 мкМ.

Аппликация Нсу в концентрации 100 и 300 мкМ усиливала выходящие К-токи. Нсу в концентрации 100 мкМ в присутствии NADH во внутриклеточном растворе приводил к более значительному усилению выходящих токов. Наибольшее увеличение наблюдалось на 3 минуте аппликации (рис.1.)

Рис.1. Влияние гомоцистеина на выходящие калиевые токи в GH3 клетках гипофиза крысы.

Вольтамперные характеристики токов.

При аппликации Нсу в концентрации 100 мкМ;

Аппликация блокаторов ВК-каналов – паксиллина в концентрации 1 мкМ или ТЕА в концентрации 1 мкМ – приводила к значительному снижению выходящих К-токов. Нсу на фоне действия блокаторов не проявлял своего эффекта (рис.2.)

Рис.2. Влияние гомоцистеина на выходящие калиевые токи в GH3 клетках гипофиза крысы.

Вольтамперные характеристики токов.

Гомоцистеин на фоне действия блокаторов.

Было предположено, что усиление выходящих К-токов связано с активацией ВК-каналов. Для выявления эффекта Нсу на активность ВК-каналов, Нсу (100 мкМ) апплицировали при потенциале фиксации +30 мВ). Нсу в концентрации 100 мкМ вызывал повышение вероятности открытия каналов до 125±7% (1 мин аппликации), до 144±16% (2 мин), до 137±20% (3 мин), Нсу в концентрации 300 мкМ повышал до 127±12% (1 мин), до 137±18% (2 мин), до 134±12% (3 мин) (p<0.05, n=14) (рис.3). При этом значения амплитуды токов и временные характеристики не изменялись

Рис.3. Активность ВК-каналов в контроле и при аппликации Нсу

Вероятность открытия ВК-каналов в контроле, при аппликации гомоцистеина в концентрации 100 мкМ и в условиях отмывки.

Таким образом, гомоцистеин в концентрациях 100 и 300 мкМ усиливает выходящие К-токи в культуре GH3 клеток гипофиза крысы и увеличивает активность ВК-каналов, что может опосредовать как физиологические, так и патологические эффекты данной аминокислоты в возбудимых тканях.

Закирьянова г. ф.

«Казанский (Приволжский) федеральный университет»