Оптимизация методов определения свободных аминокислот для изучения биологической активности почв сельскохозяйственных угодий

Свободные аминокислоты (АМК) почвы обладают высокой биохимической активностью, являются одним из источников азотного питания растений, а также одним из факторов отражающих микробиологическую активность почвы [1]. Аминокислоты участвуют в обмене и миграции металлов в системе почва-растение-животное, что обусловлено их способностью образовывать соединения хелатной структуры [2]. Поэтому изучение содержания свободных форм АМК в почве представляет научный и практический интерес как для фундаментальных исследований проходящих в почве процессов, так и для оценки плодородия сельскохозяйственных земель.

Вначале, свободные АМК необходимо извлечь из почвы. Наиболее часто их получают экстрагированием из почвы различными растворами. В нашей работе для этой цели использовали: воду, 20% этанол и 1М KCl [3, 4].

После получения вытяжек из почвы необходимо определить в них концентрацию свободных АМК. Для этой цели могут использоваться аминокислотные анализаторы, газовые и жидкостные хроматографы. Нами было выбрано хроматографическое определение АМК, так как современная высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является универсальным методом, который позволяет анализировать не только концентрацию свободных аминокислот, но и многих других компонентов почвенного раствора и вытяжек из почвы.

В большинстве молекул аминокислот отсутствуют хромофорные группы, поэтому для эффективного определения детектором хроматографа, необходима их химическая модификация. Среди множества модификаторов нами был выбран фенилизотиоцианат (ФИТЦ), так как он, реагируя с аминокислотами, дает стабильные производные. Эти производные можно определить УФ-детектором на длине волны 254нм. Полученные производные АМК определялись на ВЭЖХ Flexar, (Perkin Elmer, США) с УФ-детекором. Разделение АМК проводили на колонке Brownlee Analytical C18 (150×4,6 мм; 3мкм) по методике [5] с модификациями.

Почти во всех полученных вытяжках было определено по 16-17 протеиногенных аминокислот. Однако, в вытяжках из почвы, кроме аминокислот находятся множество других органических и неорганических компонентов. Такая сложная матрица вытяжки может мешать модификации аминокислот фенилизотиоцианатом. Проверка влияния матрицы вытяжек на процедуру модификации ФИТЦ проводилась методом стандартных добавок. Анализ вытяжек 1М KCl показывал заниженные результаты. В почвенных растворах, водных и спиртовых вытяжках влияние матрицы не наблюдалось.

Как известно, металлы способны образовывать с аминокислотами прочные комплексы [6]. После внесения в почвы сельскохозяйственных земель микроудобрений содержащих большое количество ионов металлов (к примеру, меди), свободные аминокислоты могут образовывать с ними хелатные комплексы. Вследствие образования комплексов, изменяется доступность аминокислот для растений и микроорганизмов, а иногда хелатные комплексы могут работать даже как антимикробные агенты [7]. Образование комплексов так же может сильно мешать процедуре модификации при определении аминокислот в вытяжках. Для проверки этой гипотезы, почва обрабатывалась водными растворами CuSO₄ с разной молярностью. В полученных вытяжках определялись свободные аминокислоты. Результаты показали: чем больше ионов меди в растворе, тем хуже идет модификация аминокислот.

Таким образом, отработана методика определения свободных аминокислот для оценки биологической активности почв сельскохозяйственных угодий, включающая модификацию аминокислот реагентом фенилизотиоцианат и хроматографическое определение ФИТЦ-производных аминокислот. Самым быстрым и удобным способом извлечения аминокислот является их экстракция водой или этанолом. В почвенных растворах, водных и спиртовых вытяжках влияние матрицы на количество определенных аминокислот не наблюдалось. Тем не менее, во всех случаях рекомендуется проводить проверку влияния матрицы вытяжек на конечные результаты, что наиболее актуально для сельскохозяйственных земель, куда периодически вносятся микроудобрения.

Юнусова Г.Ш.

«Казанский государственный аграрный университет»