Тема 1. Микроскопический метод исследования микроорганизмов

При выполнении любых микробиологических исследований необходимо точно знать особенности строения микроорганизмов. Эти сведения могут быть получены только путем изучения данно­го организма с помощью микроскопа. Первый простейшего уст­ройства оптический микроскоп был сконструирован Антони ван Левенгуком (рис. 1).

В настоящее время многие вопросы цитологии микробов реша­ются на уровне электронной микроскопии. Это, однако, не зна­чит, что традиционная микроскопия в видимом свете потеряла свое значение. Первоначальный подсчет количества микроорга­низмов, первичная их идентификация, изучение роста и отдель­ных элементов структуры производят с помощью светового мик­роскопа. Микробиологические лаборатории оснащены микроско­пами различных моделей: МБР-1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, «Биолам», Р-1 и др. Микроскопированием определяют морфологические особенности микроорганизмов, их тинктори-альные (способность окрашиваться теми или иными красителями) свойства, подвижность, наличие специальных структурных эле­ментов (спора, капсула).

Современный микроскоп со­стоит из оптической и механичес­кой частей. К механичес­кой части относятся шта­тив, тубус (труба) с револьверным устройством, предметный столик, механизм тонкой и грубой навод­ки (рис. 2).Штатив состоит из двух час­тей: держателя трубы микроскопа

Рис 1. Микроскоп Левенгука:

1— линза; 2—- булавка, к которой крепится объект; З, 4— фокусирующие винты

Рис. 2. Устройство оптического микроскопа;

/ — основание микроскопа; 2 — рукоятка мак-рометрнческого винта; 3 — тубусодержатсль; 4 — тубус; 5—окуляр; й—револьвер объекти­вов; 7— объектив; 8— предметный столик; 9—конденсор; 10 — осветитель;11-рукоят­ка микрометрического винта

и массивной ножки, которая служит опорой микроскопа. На штативе укреплен подвижный столик, который приводится в движение двумя винтами, рас­положенными по его бокам. При помощи этих винтов пре­парат вместе со столиком вра­щается и перемешается в разных

направлениях, что облегчает его рассмотрение. Для этой цели предназначены крестообразные устройства, которые позволяют двигать препарат в двух взаимно перпендикулярных направлени­ях. С помощью двух шкал, имеющихся на таком столике, можно отмечать участки препарата, интересующие исследователя, и отыскивать их при повторных наблюдениях.

В тубусе находится оптическая система. Он перемешается вверх и вниз при помощи двух винтов. Для более грубого переме­щения служит зубчатка, или кремальера. Точная установка дости­гается движением микровинта с мелкой нарезкой: полный оборот микровинта передвигает тубус на 0,1 мм.

В нижней части тубуса имеется револьверное устройство, в ко­торое можно ввинчивать 4 объектива (на некоторых микроскопах 5) и переключать их во время работы. В верхнее отверстие тубуса вставляется окуляр.

Оптическая часть микроскопа состоит из окуляров, объективов, конденсора и зеркала.

Зеркало отражает падающий на него свет и направляет его в конденсор для освещения препарата. Одна сторона зеркала плос­кая; ею пользуются при любом источнике света и при любом уве­личении. Другая, вогнутая, сторона зеркала предназначена для ра­боты без конденсора при малых увеличениях.

Конденсор состоит из нескольких линз, собирающих отражен­ный зеркалом свет в пучок и направляющих его па плоскость пре­парата. В нижней части конденсора расположена ирисовая диаф­рагма, посредством которой можно менять угол лучей и количе­ство пропускаемого конденсором света. Фокусировку конденсора осуществляют специальным микровинтом.

Наиболее важная часть микроскопа — объектив. Он представ­ляет собой систему линз, строящих действительное увеличенное и перевернутое изображение объекта. Наружная, или передняя, линза носит название фронтальной. Даваемое ею изображение объекта страдает рядом аберраций, свойственных каждой простой линзе. Эти аберрации устраняются вышележащими коррекцион-ными линзами.

Объективы по способности устранять аберрации бывают следу­ющие: ахроматы, апохроматы и с плоским изображением. Ахрома­ты более распространены вследствие простоты и дешевизны. В них 6 линз из оптического стекла, изображение наиболее резкое в центре. Апохроматы более совершенно устраняют хроматическую погрешность, их резкость и величина изображения более равно­мерная в лучах разной длины волн: их используют совместно со специальными компенсационными окулярами.

Каждый объектив характеризуется свойственным ему собствен­ным увеличением, фокусным расстоянием, численной апертурой и некоторыми другими константами. Увеличение объектива и зна­чение его апертуры обычно обозначены на оправе.

Под численной апертурой (А) объектива понимают произведе­ние синуса половины угла лучей, входящих в объектив (и), и пока­зателя преломления среды (п), находящейся между покровным стеклом препарата и фронтальной линзой объектива:

А = sin« ■ п.

Если этой средой является воздух, то ввиду того, что показатель преломления воздуха равен единице (1), численная апертура «су­хих» объективов практически не может быть выше 0,95. Чтобы ее повысить, объектив иммерсируют, т. е. погружают в специальную среду (воду, глицерин, иммерсионное масло), показатель прелом­ления которой больше такового воздуха.

Работа с иммерсионным объективом состоит в следующем. Предварительно наносят сверху на препарат каплю иммерсионно­го масла, а затем, опуская осторожно тубус, погружают в него объектив. Так как показатели преломления стекла и масла близки между собой, то таким образом устраняется возможность слишком большого рассеивания лучей (рис. 3 и 4).

Окуляр микроскопа — это увеличивающая оптическая система, через которую рассматривается действительное изображение объекта, которое дает объектив. Окуляр состоит из двух линз: соби­рающей, обращенной к объективу, и глазной, обращенной к глазу. Между ними находится диафрагма, которая задерживает боковые лучи и пропускает лучи, близкие к оптической оси и дающие более контрастное изображение. Окуляр еще раз увеличивает построен­ное объективом изображение объекта, но не раскрывает новых де­талей его строения. Собственное увеличение окуляра (F_0K) равно расстоянию наилучшего видения для нормального глаза (250 мм), деленному на фокусное расстояние (/) линз:

Рис. 3. Объектив оптического микроскопа;

/—фронтальная линза; d — предметное стекло; п = 1 — показатель преломления воздуха; п= 1,33 —показатель преломления воды; л = 1,515 —показатель преломле­ния иммерсионного (кедрового) масла

Оптическая мощность микроскопа включает в себя возможное увеличение, разрешающую силу и способность точного изображе­ния, зависящую от устранения аберраций.

Общее увеличение микроскопа равно произведению уве­личения объектива и увеличения окуляра .

Под разрешающей способностью микроскопа (а) понимают наименьшее расстояние между двумя точками объекта, которые воспринимаются глазом раздельно и не сливаются в одну: чем меньше размер частицы, видимой в микроскоп, тем больше его разрешающая способность.

Чем меньше длина волны света и чем больше числовая апертура, тем меньшие детали объекта можно рассмотреть в микроскопе.

Разрешающая способность микроскопов увеличилась благода­ря усовершенствованию оптики, применению иммерсионных объективов и конденсоров с апертурой, равной апертуре объекти­ва. Повышение разрешающей способности микроскопа ограничи­вается длиной волны света. При встрече с объектом меньше ее длины световая волна «обтекает» объект и предмет остается неви­димым.

Рис. 4. Ход лучей в иммерсионной системе:

I — иммерсионное масло (п- 1,515); 2 — фронталь­ная линза иммерсионного объектива; 3— предмет­ное стекло (я = 1,52); 4— воздух

Наименьшие частицы, которые удается рассмотреть в совре­менных световых микроскопах, должны иметь величину больше '/з длины волны света. Следовательно, при пользовании видимой ча­стью дневного света, включающей волны от 400 до 700 нм, в мик­роскопе могут быть обнаружены частицы величиной не менее 200 нм. Чтобы довести эту величину до размеров, видимых глазом, разрешающая способность которого составляет 0,2 мм, необходи­мо увеличить объект в 1000 раз. Это увеличение принято считать полезным.

Определение размеров микроорганизмов. Размеры бактерий варьируют в широких пределах — от 0,2 мкм до 125 мкм; у большинства патогенных бактерий — от десятых долей микрометра до нескольких микрометров.

При характеристике размеров бактерий обычно указывают длину и ширину клетки в микрометрах {10~³ мм). В качестве инст­рументов измерения используют окуляр- и объект-микрометры.

Окуляр-микрометр — стеклянная пластинка, на которой линия в 5 мм разделена на 10 или 20 делений {размещают в окуляре).

Объект-микрометр — предметное стекло с линией длиной 0,5 или 1,0 мм, разделенной на сотые доли (рис. 5 и 6).

Объект-микрометр помещают на предметный столик и, глядя в окуляр с окуляр-микрометром, совмещают начальную черту в объект- и окуляр-микрометрах. Затем определяют цену деления окуляр-микрометра при данных окуляре и объективе.

Пример. Шкала объект-микрометра составляет 1 мм, и одно ее деление равно 10~² мм, т. е. 10 мкм. При совмещении шка­лы объект-микрометра три его деления (т. е. 30 мкм) соответству­ют 14 делениям окуляр-микрометра, отсюда одно деление окуляр-микрометра составляет 30: 14 =2,14 мкм. После того как опреде­лена цена одного деления окуляр-микрометра, вместо объект-микрометра помещают препарат с исследуемым объектом. Например, палочковидный микроб по длине занимает 3, а по ши­рине—0,5 деления окуляр-микрометра: если одно деление оку­ляр-микрометра составляет 2 мкм, то длина бактериальной клетки будет 3-2 = 6 мкм, а ширина — 0,5 -2=1 мкм.

При микроскопировании существенное значение имеет освещение исследу­емого объекта. Освещение чаще устанавливают по методу Келера:

1. 

   

   Осветитель (желательно использовать стандартные ос­ ветители ОИ-7 и ОИ-19, у ко­ торых микролампу с неболь­ шой плотно скрученной спира­ лью можно передвигать вдоль оси осветителя) располагают на расстоянии 30...40 см от мик­ роскопа.

2. На предметный столик

кладут препарат; объектив х8

переводят в рабочее положение.

Рис. 5. Микрометры:

а — общий ввд; б— объект-микрометр; в-окуляр-микрометрггрр

3. Конденсор поднимают до упора; ирисовую диафрагму пол­ностью открывают.

4. Зеркало устанавливают плоской поверхностью и почти полстью закрывают диафрагму осветителя.

5. На зеркало помещают лист белой бумаги и, передвигая пат­рон осветителя, добиваются четкого изображения на бумаге его нити накала лампы.

6. Глядя в окуляр, при помощи зеркала получают в центре поля зрения изображение краев диафрагмы осветителя — светлое пятно с нерезко очерченными краями.

7. Используя объектив х8, фокусируют объект в области свет­ лого пятна.

8. Опуская конденсор, в плоскости препарата фокусируют изображение краев диафрагмы осветителя и движением зеркала переводят светлое пятно в центр поля зрения.

9. Диафрагму осветителя открывают до тех пор, пока светлое пятно не закроет все поле зрения.

10. В дальнейшем положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не меняют.

0 5 10 15 20 25

0 12 3 4 5 6

- Окуляр-микрометр • Объект-микрометр

Рис. 6. Определение цены деления окуляр-микрометра.

При работе с учебным микроскопом освещение нередко устанавливают уп­рощенным способом. При­ступая к работе, следует проверить состояние кон­денсора: он должен быть приподнят, диафрагма открыта. Приподняв тубус микроскопа, устанавливают объектив с наименьшим увеличением (х8, хЮ) и, глядя в окуляр, при помощи зеркала добиваются полно­го освещения поля зрения. На исследуемый препарат наносят кап­лю кедрового масла (или его заменителя), помещают препарат на предметный столик и поворотом револьвера устанавливают иммер­сионный объектив. (Чтобы избежать соприкосновения объектива со столиком, тубус следует держать приподнятым.) Под контролем глаза (смотреть сбоку) фронтальную линзу объектива легким пово­ротом макрометрического винта погружают в каплю иммерсионно­го масла и, наблюдая в окуляр, осторожно поднимают тубус до ви­димости препарата. Затем легкими поворотами микрометрического винта (вперед-назад) регулируют четкость изображения.