Определение Col-плазмид (колицикогенных факторов).

Исследуе­мые культуры Е. coli засевают методом укола в питательный агар в чашке Петри (7...8 уколов на 1 чашку). Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего на внутреннюю поверхность чашки помещают кусочек ваты, смоченный хлороформом, в парах которого погибают бактерии. Затем по поверхности агара равно­мерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного до 45 °С полужидкого (0,7 %) питательного агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной индикаторной культуры. В качестве таковой подбирается наиболее чувствительная к данному типу колицина культура Е. coli. Через 18...24ч инкубации посевов при 37 °С учи­тывают результаты опыта. Вокруг посевов исследуемых культур, продуцирующих колицины, появляются прозрачные зоны подав­ления роста индикаторного штамма.

Определение колицинотипа. В питательный агар в чашке Петри методом укола засевают эталонные штаммы бактерий с известным колициногенотипом. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего бактерии убивают в парах хлороформа. Затем по поверх­ности агара равномерно распределяют Змл расплавленного и осту­женного полужидкого агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульон­ной культуры Е. coli неизвестного колициногенотипа (например, Col A, Col В и др.). Через 18...24ч отмечают результаты опыта по нали­чию или отсутствию роста. Исследуемая и индикаторная культуры имеют один и тот же колициногенотип, т. е. содержат идентичные Col-плазмиды. В противном случае вокруг эталонных штаммов по­являются прозрачные зоны подавления роста бактерий.

Метод генных зондов.

Используют достаточно часто для иден­тификации бактерий. От обычной ДНК —ДНК гибридизации этот способ отличается использованием не тотальной ДНК, а оп­ределенного ее фрагмента (зонда), содержащего известный ген (генетический маркер).

Предварительно создают «банк генов» изучаемой бактерии. С этой целью бактериальную ДНК расщепляют эндонуклеазами, фрагменты ДНК разделяют с помощью электрофореза, методом трансформации определяют их генетические характеристики, от­бирают нужный фрагмент ДНК и при помощи лигазы включают в плазмиду, которая служит вектором. Плазмиду с интегрирован­ным известным геном вводят в какой-либо бактериальный штамм, обычно достаточно легко культивируемый. Получают большое ко­личество биомассы, содержащей ДНК-зонд. Выделяют плазмид-ную ДНК, метят ее радиоактивным изотопом, затем эту меченую ДНК гибридизируют с ДНК изучаемой бактерии. Методом ауто-радиографии выявляют относительную частоту гибридизации маркера с изучаемой ДНК и по этому показателю судят о генети­ческом родстве известной бактерии — донора ДНК и исследуемой бактерии.

Полимеразная цепная реакция — ПЦР (polymerase chain reaction — VCR). Принцип реакции состоит в том, что при помощи ДНК-полимеразы in vitro многократно син­тезируют копии определенного участка ДНК (амплификация — накопление).

ПЦР — циклический процесс, каждый цикл которого включает в себя три стадии.

1. Тепловая денатурация (95 °С) исследуемой ДНК. При этом разрушаются водородные связи, соединяющие парные основания, и цепи ДНК расходятся, т. е. образуются одноцепочечные ДНК, которые доступны для праймерон (затравок) и ДНК-полимеразы. Длительность процесса 1 мин.

2. Посадка (отжиг) праймеров на комплементарные участки двух антипараллельных цепей ДНК. Праймеры представляют собой два синтетических олигонуклеотида из 20...30 нуклеотидов, каждый из которых комплементарен противоположной цепи ДНК в участ­ ках, о!"раничивающих выбранный сегмент ДНК возбудителя. Таким образом праймеры ограничивают специфический для возбудителя участок ДНК. Праймеры добавляют в реакционную смесь в избыт­ ке, что позволяет им занять свои комплементарные участки до того, как произойдет соединение (ренатурация) одноцепочечных ДНК в двухцепочечную. Длительность стадии 1...2 мин.

3. Процесс достройки (элонгации) праймера из внесенных в реакционную смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов при участии ДНК-полимеразы. Используют обычно термостабильную ДНК- полимеразу термофильной бактерии Thermos aquaticus (Taq-поли- мераза), что позволяет вести полимеризацию при оптимальной температуре 70...75 °С. При синтезе ДНК праймеры включаются в ее молекулу. Синтез ДНК с помощью полимеразы протекает толь­ ко между праймерами; при этом удваивается число копий именно этого участка ДНК. Молекула ДНК, синтезированная при помо­ щи одного праймера, может служить матрицей для синтеза комп-

лементарной ДНК при помощи другого праймера. Длительность этой стадии 1...2мин.

По завершении 1-го цикла реакцию тормозят и ДНК вновь подвергают температурной денатурации. При охлаждении избы­точные праймеры опять гибридизируются с цепями исходной и вновь синтезированной ДНК. Добавление ДНК-полимеразы обес­печивает 2-й цикл полимеризации. Таким образом можно провес­ти несколько десятков циклов ферментативного удлинения прай-меров, в результате число сегментов ДНК, ограниченных с обеих сторон праймерами, с каждым циклом увеличивается экспонен­циально. Следовательно, используя метод ПЦР, можно in vitro из­бирательно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион раз и более. Факт увеличения числа фрагментов ДНК служит доказательством присутствия в ис­следуемом образце гомологичной ДНК, т. е. возбудителя инфек­ционной болезни.

Для практического использования ПЦР необходимо синтези­ровать праймеры, комплементарные 3'-концам цепей копируемой ДНК-матрицы и ограничивающие копируемый фрагмент ДНК. Их выбирают на основе участков генома возбудителя с расшифро­ванной нуклеотидной последовательностью и устойчивых к гене­тическим перестройкам. Например, для идентификации C.psittaci были предложены праймеры, выбранные на основе гена, кодиру­ющего белок наружной мембраны, или на основе гена, кодирую­щего 16s pPHK; для идентификации бруцелл был выбран праймер на основе гена, кодирующего белок внешней мембраны 31 КДа, и т.д.

Для проведения ПЦР-диагностик и необходимы следующие компоненты: водные растворы дезоксинуклеозидтрифосфатов че­тырех типов (gATO, gTTO, glTO, gUTO, 10 мМ, рН 7,0); первый праймер (5 мМ); второй праймер (5 мМ); фермент Taq-полимера-за (5 ЕД/мкл); амплифицируемая ДНК (-1 мкг); ионы Mg^2f для обеспечения работы полимеразы (25 мМ); буферный раствор (10-кратный концентрат), например трис-соляная кислота (рН 6,8...7,8) с добавлением бычьего альбумина и неионных детерген­тов.

Указанные компоненты вносят в пробирку, например, в следу­ющих количественных соотношениях: раствор дезоксинуклеозид­трифосфатов — 8 мкл, буфер — 10 мкл, амплифицируемая ДНК — ~1 мкг, праймеры —по 1„.5мкл, полимераза — 0,5 мкл, дистил­лированная вода — до 100 мкл. Для предотвращения испарения на жидкость в пробирке наслаивают минеральное масло. На первом этапе проведения ПЦР денатурируют ДНК, затем в реакционную смесь, содержащую дезоксинуклеозидтрифосфаты, вносят поли-меразу, помещают в амплификатор или термоциклер (программи­руемый термостат). Амплификацию проводят в термоциклере по заданной программе, например: 90 °С — 1 мин, 60 °С— 1 мин, 72 °С — 1мин (5 циклов), 93 °С — 1 мин, 57 "С - 1 мин, 92 °С — I мин (5 циклов); 93 "С — 1 мин, 55 °С — I мин, 72 °С — 3 мин (25 циклов).

После завершения амплификации следует этап обнаружения продуктов ПЦР — амплификонов. Молекулы ДНК и их фрагмен­ты разделяют электрофорезом в агаровом геле. ДНК в геле окра­шивают бромидом этидия с последующим анализом и фотографи­рованием фореграмм под УФИ. Специфичность полосы ампли-фицированной ДНК подтверждают сравнением с маркерными фрагментами и ДНК-стандартом. Дополнительно специфичность амплификона можно подтвердить путем гибридизации со специ­фическим радиоактивным зондом.

Объектом исследования в ПЦР могут служить как ткани, со­держащие возбудитель, так и культуры возбудителя. Из материала обычно тем или иным способом извлекают ДНК. В зависимости от характера материала методы его обработки варьируют.

Ценность ПЦР-диагностики возрастает, когда необходимо об­наружить возбудителей инфекционных болезней или труднокуль-тивируемых, или находящихся в нетипичной форме (L-формы бактерий), а также выявить гены, контролирующие тот или иной фактор патогенности микроорганизма. В повседневной диагнос­тической практике обычно ограничиваются установлением факта патогенности микроорганизма; при оценке биопрепаратов необ­ходимы количественные характеристики вирулентности микроор­ганизма, взятого для заражения животного.