Постановка опыта трансформации.

Реципиент —- штамм Bacillus subtilis Str^s (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину). До­нор — ДНК, выделенная из штамма В. subtilis Str^r (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) — питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.

К 1 мл бульонной культуры В. subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем в пробирку вносят смесь 0,1 мг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл хлори­да магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдерживают в течение 5 мин.

Для определения количества образовавшихся стрептомицинус-тойчивых рекомбинантов (трансформантов) 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для опреде­ления числа клеток реципиентной культуры готовят ее десяти­кратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10~⁵...10~° (для получения сосчитываемого числа колоний), высе­вают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина и для кон­троля—на агар со стрептомицином (реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину). Посев инкубируют при 37 "С. На следующий день учитывают ре­зультаты опыта и определяют частоту трансформации по отноше­нию количества выросших рекомбинантных клеток к числу кле­ток реципиентного штамма.

Пример. Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реци­пиентного штамма в разведении 10~^s выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси — 68 колоний рекомбинантно-го штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножений только одной бактериальной клетки то в 0,1 мл за­сеянной культуры реципиента содержится 170 ■ 10^s жизнеспособ­ных клеток, а в 1 мл — 170 ■ 10⁶ , или 1,7 ■ 10⁸. В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинантных клеток, а в 1 мл — 680, или 6,8 ■ 10².

Постановка опыта специфической трансдукции.

Реципиент — штамм Е. coli 1ас~, лишенный 3-галактозидазного оперона, конт­ролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг — фаг X dgal, в геноме которого часть генов замещена р-галактози-дазным опероном Е. coli. Он является дефектным, т. е. неспособен вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг X dgal) с назва­нием содержащегося в его геноме бактериального оперона gal. Се­лективная среда — среда Эндо, на которой лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма приобретают красный цвет с металлическим оттенком.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага X dgal в концентрации 10^й... 10⁷ частиц в 1мл. Смесь инкубируют при 37 "С в течение 60 мин, после чего готовят ряд 10-кратных разведений (в зависи­мости от предполагаемой концентрации бактерий) для получения сосчитываемого числа колоний. Из пробирки с разведением 10~⁶ делают высев по 0,1 мл культуры на три чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверх­ности среды. Посевы инкубируют в течение суток, после чего от­мечают результаты опыта и вычисляют величину трансдукции по отношению числа клеток рекомбинантов (транедуктантов), об­наруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штам­ма. Так, например, после посева 0,1 мл смешанной культуры в разведении 10~6 на трех чашках со средой Эндо выросло соответ­ственно 138, 170 и 160 бесцветных колоний реципиентного штам­ма, на первой и последних чашках — 5 и 1 колоний транедуктан­тов красного цвета.

Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромо­сомы, содержащего ген leu, контролирующего синтез лейцина. До­нор—штамм E.coli К12 Hfr leu Str1. Реципиент — штамм E.coli K12F leir Sir1". Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая: КН2РО4 — 6,5 г, MgSO4 — 0,1 г, 9(NH4);.Sa,-lr, Ca(NO3)2-0,001r, FeSO4-0,0005 г, глюкоза-2 г, стрептомицин — 200 ЁД/мл, дистиллированная вода — 1 л.

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульон­ной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10~2... 10~3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри: должны вырасти только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же сре­ду высевают донорный и реципиентный штаммы, которые не бу­дут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрепто­мицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Кроме того, культуру донорного штамма высевают на селективную среду без стрептоми­цина, а культуру реципиентного штамма —на полную среду (пи­тательный агар) с антибиотиками для определения числа жизне­способных клеток. Посевы инкубируют до следующего дня при 37 °С. После подсчета числа выросших колоний определяют час­тоту рекомбинаций по отношению числа рекомбинантных клеток к реципиептным. Так, например, после посева 0,! мл смеси до-норных и реципиентных культур в разведении 10~2 выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры реципи­ента из разведения 10""6 —75 колоний.

Постановка опыта конъюгации с целью передачи R-плазмнды, контролирующей множественную устойчивость к антибиотикам

(стрептомицину (Sir¹), тетрациклину (Тс¹) и хлорамфениколу (Cm¹)- Донор штамм Е. coli K12 R⁺leirStr^rTc^rCm^s. Реципиент — штамм E.coli K12 Rrleu⁺Str^rTc^sCm^s. Селективная среда —мини­мальная глюкозосолевая среда, содержащая упомянутые антибио­тики в концентрации 50 мкг/мл каждый.

В стерильную пробирку вносят по 1 мл 3~часовой бульонной культуры донора и реципиента. Смесь инкубируют при 37 °С в те-

чение 2 ч и высевают в объеме 0,1 мл на чашки с селективной сре­дой, содержащей 3 антибиотика. На данной среде вырастут только колонии рекомбинантов (трансконъюгантов), которые приобрели резистентность к данным антибиотикам. Отсутствие роста донор-ного и реципиентного штаммов на этой среде объясняется тем, что донорный штамм нуждается в лейцине, а второй чувствителен к антибиотикам.

Частоту формирования трансконъюгантов определяют по отноше­нию числа клеток трансконъюгантов к числу клеток реципиентного штамма. Так, например, при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении 10"⁴ на глюкозосолевую среду с лейцином полу­чено 20 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси — 60 коло­ний трансконъюгантов.