Тема 9. Методы изучения генетики бактерий

Генетические механизмы изменчивости бактерий обусловле­ны модификациями, мутациями, рекомбинациями, а также плаз-мидами и умеренными фагами, ДНК которых встраивается в клеточный геном. При этом изменяется один или несколько признаков одновременно в зависимости от числа мутировавших (при мутациях) или приобретенных (при рекомбинациях) генов. Так, например, при S -) R мутации, как правило, изменяются морфология колонии, антигенные и вирулентные свойства бак­терий.

Плазмиды контролируют разнообразные признаки у бактерий: образование бактериоцинов — колицинов (Col-плазмиды), резис-тентность к антибиотикам (R-плазмиды) и многие другие. Коли-цины, образуемые разными сероварами Е. coli, могут отличаться друг от друга по спектру чувствительных к ним бактерий. Метод определения спектра чувствительных к определенному колицину бактерий называется колицинотипированием, а метод определе­ния типа самой Col-плазмиды (Col A, Col В и др.) — колициноге-нотипированием. Данные методы позволяют маркировать бакте­рии одного и того же вида или биовара, что имеет эпизоотическое значение для установления источника инфекции.

R-плазмиды контролируют образование ферментов, разрушаю­щих или модифицирующих разные антибиотики, например бета-лактамаз, разрушающих пенициллины. R-плазмиды благодаря своей трансмиссивности передаются от одних бактерий другим, способствуя тем самым формированию антибиотикорезистентных популяций бактерий.

Индукции мутаций под действием ультрафиолетового излучения

(УФИ). Воздействие УФИ индуцирует у бактерий, в частности Е. coli, предмутационные повреждения и широкий спектр мута­ций, включая замены оснований, образование делений и др.

В качестве источника УФИ используют бактерицидную лампу ВУФ-15, которую устанавливают на расстоянии 60 см от центра облучаемого объекта. Поскольку Е. coli обладает эффективными механизмами световой репарации УФ-поврсждений ДНК, то об­лучение желательно проводить в темноте или при красном свете. Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, на основании которой устанавливают оптимальную мутагенную дозу, равную 0,1... 1 % от числа выживших бактерий.

Для получения lac-мутантов Е. coli испытуемую культуру пред­варительно выращивают в питательном бульоне в течение 14...18 ч. При этом концентрация бактериальных клеток в 1 мл среды составляет примерно 2 ■ 10⁸. Клетки осаждают центрифуги­рованием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 М раствора MgSO₄ и охлаж­дают во льду для прекращения деления клеток. Суспензию в объе­ме 50 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в тече­ние 15... 150 с, после чего клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в таком же объеме питательного бульона. Про­бирку с бульонной культурой инкубируют при 37 "С в течение 14...18ч. Затем из разведений 10~³...10~⁵ по 0,1мл высевают на плотную селективную питательную среду (среда Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов использу­ют штамм Е. coli В или К 12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиоти­ка. Например, ампициллин—10мкг/мл, левомицетин — 5мкг/мл, пенициллин — 100 мкг/мл.

На среде Эндо lac-мутанты Е. coli образуют бесцветные коло­нии. Клетки Е. coli, выросшие на среде с указанной концентраци­ей антибиотика, резистентны к нему. Параллельно ставят конт­рольные посевы.