2.2. Характеристика будови клітин і життєвого циклу дріжджів

Вегетативний поділ клітин дріжджів зазвичай відбувається брунькуванням, під час якого дочірня клітина виникає із виросту на материнській клітині, після чого настає подвоєння ядер, утворення нової клітинної стінки і, врешті-решт, від’єднання дочірньої клітини. Розміри гаплоїдних і диплоїдних клітин змінюються залежно від фази росту і штаму. Типово, диплоїдні клітини є еліпсоїдами (5 × 6 мкм), а гаплоїди є сфероїдами діаметром 4 мкм.

• гаплоїдних клітин нові бруньки з’являються поблизу попередньої, тоді як

• диплоїдів вони виникають на протилежному полюсі клітини. Кожна материнська клітина утворює не більше 20–30 бруньок. Вік клітини можна визначити за кількістю «шрамів» на клітинній стінці, що залишаються після від’єднання дочірніх клітин.

32

Деякі диплоїдні штами S. cerevisiae можуть виявляти особливу морфологію клітин і колоній – псевдогіфи під час росту на агаризованому середовищі, дефіцитному за джерелом азоту. Ці псевдогіфові клітини є видовженими, і пари «материнська клітина – дочірня клітина» залишаються з’єднаними.

Час генерації стандартних лабораторних гаплоїдних штамів S. cerevisiae становить приблизно 90 хв на повному середовищі YPD (1% дріжджового екстракту, 2% пептону і 2% глюкози) і майже 140 хв на синтетичному середовищі в експоненційній фазі росту при оптимальній температурі 30°C. Штами зазвичай досягають найвищої густини 2×10⁸ клітин/ мл на середовищі YPD. Десятикратного титрування клітин можна досягнути лише за спеціальних умов: строгий контроль за рН середовищем, постійне додавання збалансованих поживних речовин і забезпечення ефективної аерації, що можливо лише у ферментерах.

Серед дріжджів S. cerevisiae є як гетероталічні, так і гомоталічні штами. Диплоїдні клітини обох типів можуть спорулювати за умов дефіциту поживних речовин, і особливо на спеціальному середовищі, що містить ацетат калію. Під час споруляції диплоїди входять у фазу мейозу, даючи потомство із чотирьох гаплоїдних клітин у формі спор (аскоспор), локалізованих у мішкоподібній структурі під назвою «аск». Ступінь споруляції залежить від штаму, змінюючись від кількох відсотків до майже 100%. Багато лабораторних штамів спорулюють з ефективністю вищою 50%. Більшість асків містять чотири гаплоїдні аскоспори, але бувають аски з трьома і меншою кількістю спор.

2.3. Метилотрофні дріжджі

Метилотрофні дріжджі – це еукаріотичні мікроорганізми, здатні засвоювати метиловий спирт як єдине джерело вуглецю та енергії. Серед приблизно 600 видів дріжджів, відомих на сьогодні, лише близько 50 видів здатні засвоювати метанол. Більшість із них є аскоміцетами і належать до родів: Pichia, Candida, Hansenula i

Torulopsis.

Типовими ареалами метилотрофних дріжджів є лісові, садові та заболочені ґрунти, квіти, листки, кора і сік дерев, гнилі овочі та фрукти, морські водорості, а також комахи, які живуть на деревах. Екологічна ніша характеризується наявністю пектину та лігніну – комплексних полімерів з метоксильними групами. У разі їхнього гідролізу вивільнюється метиловий спирт, який служить вуглецевим субстратом для метилотрофних дріжджів. Усі метилотрофні дріжджі є факультативнимим метилотрофами, оскільки їхній ріст можуть забезпечувати й полівуглецеві сполуки. Бродіння для метилотрофних дріжджів є нетиповим і протікає при лімітуванні кисню лише в незначній мірі. Види родів Candida i Torulopsis є аспорогенними, тоді як види метилотрофних дріжджів Hansenula і Pichia мають виражену статеву фазу, формують аски та аскоспори і піддаються техніці класичних генетичних маніпуляцій. Дисиміляційний обмін метанолу у дріжджів є відносно простий і складається з трьох послідовних ферментативних стадій окиснення метанолу до вуглекислоти.

Метилотрофні дріжджі важливі не тільки як модельні об’єкти для фундаментальних досліджень, але й як біотехнологічно цінні мікроорганізми. Вони можуть рости на дешевому субстраті, метанолі, й водночас ефективно

33

засвоювати цукри. Завдяки відсутності репресорного впливу глюкози на біосинтез дихальних ферментів у цих дріжджів, їх можна вирощувати у середовищі з високим вмістом цукру без зменшення швидкості та ефективності конверсії субстрату в біомасу. Розроблено режими культивування клітин на сумішах вуглецевих субстратів без вираженого ефекту діауксії. Дріжджі H. polymorpha є термотолерантними. Ця особливість здешевлює процедуру культивування, збільшуючи швидкість росту, полегшуючи технологію відведення тепла, перемішування (завдяки зменшенню в’язкості рідини) та спрощуючи проблему мікробіологічного забруднення. Реально існуючі та перспективні біотехнологічні процеси на основі метилотрофних дріжджів включають виробництво біомаси, ферментів, метаболітів і гетерологічних білків.

Метилотрофні дріжджі розглядають як перспективне джерело білково-вітамінних концентратів, призначених для кормових і харчових цілей. У світі відчувається дефіцит білкових ресурсів, а тому отримання відносно дешевого білка одноклітинних на метанолі привертає увагу дослідників і промисловців.

Крім універсальних метаболітів (амінокислоти, цукри, нуклеотиди, вітаміни, коферменти тощо), метилотрофні дріжджі можуть служити джерелом унікальних для дріжджів продуктів – формальдегіду, мурашиної кислоти, дигідроксіацетону.

Формальдегід у промисловості синтезують шляхом каталітичного окиснення метанолу, і його світове виробництво становить мільйони тонн на рік. Здебільшого формальдегід використовують для багатотоннажного виробництва фенол- та карбамід-формальдегідних смол, з яких отримують полімери. Частину цього альдегіду застосовують в тонкому органічному синтезі ліків, барвників, а також для інактивації вірусів, патогенних бактерій при виробництві вакцин.

Використовуючи мутант Candida boidinii з підвищеним рівнем синтезу алкогольоксидази, японські дослідники досягли нагромадження в середовищі інкубації з метанолом 1М формальдегіду. Аналогічно можна отримувати із етанолу оцтовий альдегід із використанням клітин дріжджів P. pastoris. Ацетальдегід – важлива сировина для синтезу багатьох органічних речовин і водночас ароматно-смакова добавка, яку використовують у харчовій промисловості для надання напоям, м’ясним, овочевим та фруктовим консервам, есенціям та жувальній гумці специфічного відчуття свіжості , а тому розроблення ефективного мікробіологічного способу отримання цієї сполуки є досить актуальною проблемою. За оптимальних умов найліпші штами метилотрофних дріжджів дають практично 100% виходу ацетальдегіду. Доведено, що клітини C. boidinii є ефективними для отримання не тільки формальдегіду, ацетальдегіду, пропіональдегіду із відповідних спиртів, а й навіть дуже токсичного акролеїну із алілового спирту.

Біотехнологічний процес конверсії метанолу в форміат розроблено з використанням іммобілізованої ферментної системи, що включає алкогольоксидазу, каталазу і бактерійну формальдегіддисмутазу, або суміші інтактних клітин дріжджів H. polymorpha та бактерій Pseudomonas putida. У цьому процесі метанол окиснюється алкогольоксидазою до формальдегіду, який формальдегіддисмутаза перетворює в форміат і метанол.

34

З огляду на широке використання у сучасній косметиці гідрофільних гелевих кремів із включеннями дигідроксіацетону, перспективним є використання метилотрофних дріжджів для мікробіологічного синтезу цього живильного для шкіри косметичного засобу. Одними із ефективних продуцентів сполуки є мутанти H. polymorpha з блоком дигідроксіацетонкінази, здатні перетворювати метанол у дигідроксіацетон. За наявності додаткового генетичного блоку гліцеролкінази такі мутанти нагромаджують у середовищі суміш тріоз-дигідроксіацетону і гліцерол. Описано інший метилотрофний продуцент гліцеролу – мутант C. boidinii з блоком гліцерол-3-фосфатдегідрогенази.

Метилотрофні дріжджі є перспективним джерелом для промислового виробництва амінокислот, зокрема, аланіну, глутамату, лізину, метіоніну, треоніну, валіну і триптофану. Ефективні метилотрофні дріжджі і як продуценти АТФ. Вихідним субстратом для конверсії можуть служити АМФ, аденозин або аденін. Пермеабілізовані клітини C. boidinii в разі інкубації з метанолом трансформують аденозин у АТФ до концентрації 0,2 М з виходом 77%.

Сконструйовано дуже ефективний генно-інженерний штам C. boidinii – продуцент АТФ, у якого ген аденілаткінази S. cerevisiae експресується під контролем промотора гена алкогольоксидази C. boidinii. Індуковані метанолом трансформанти мали в 10 000 разів вищий рівень активності аденілаткінази, ніж вихідні клітини, і трансформували аденозин до АТФ у 23 рази ефективніше , ніж контрольні клітини. Вихід АТФ становив 0,23 М (117 г/л) за 45 год інкубації.

У зв‘язку з високим вмістом алкогольоксидази в клітинах метилотрофних дріжджів цей флавопротеїн (як і самі клітини) можна розглядати як дешеве джерело отримання флавінаденіндинуклеотиду. Розроблено м‘який гліцероловий метод дисоціації октамерної форми алкогольоксидази із вивільненням ФАД. Крім того, ФАД можна отримувати і шляхом трансформації екзогенного рибофлавіну або ФМН клітинами метилотрофних дріжджів – до 45 мг/л. Цікаво, що ВЕРХ (HPLC)-аналіз ФАД, екстрагованого як із препаратів очищеної алкогольоксидази , так і клітин, виявив його гетерогенність і наявність, крім звичайної форми, модифікованого варіанта коферменту – т. зв. “mOФАД”.

Серед ферментів метилотрофних дріжджів найбільше практичне значення має алкогольоксидаза. Цей фермент каталізує окиснення метанолу киснем повітря з утворенням формальдегіду та пероксиду водню. Алкогольоксидаза здатна окиснювати й інші первинні аліфатичні спирти, зокрема, етанол:

СН₃СН₂ОН + О² → СН₃СН=О + Н₂ О₂ На цих реакціях ґрунтується аналітичне використання алкогольоксидази для

визначення вмісту етанолу та метанолу.

За умови зниження собівартості виробництва алкогольоксидази у великих масштабах (зараз ця величина є занадто високою і оцінюється в 8 000 доларів США за 1 м лн од.), перспективним є використання ферменту в складі рідких мийних засобів, антисептичних композицій для миття посуду, ванн, біостерилізації лабораторного посуду й аналітичних пристроїв, а також у складі біостерилізуючих бинтів. Усі підходи ґрунтуються на генеруванні алкогольоксидазою (за наявності алкоголю) пероксиду водню, який відбілює тканини у першому випадку і вбиває мікроорганізми – у другому. Наприклад, при

35

внесенні у відбілюючий концентрат неіонних детергентів і 8% етанолу алкогольоксидаза стає неактивною, але реактивується при розведенні композиції

водою у 100 разів. Протягом півгодини при температурі 40°С у мийному розчині продукується до 25 мМ пероксиду водню, що цілком достатньо для відбілюючого ефекту. Слід відмітити, що використання алкогольоксидази в такій системі дало б можливість запобігти негативному впливу на довкілля широко вживаних хімічних засобів відбілювання тканин на основі перборатів.

Дріжджі як організм-господар для експресії еукаріотичних гетерологічних білків поєднують переваги молекулярно-генетичних маніпуляцій і ростових характеристик прокаріотичних організмів та субклітинного апарату посттрансляційної модифікації білків еукаріот. Порівняно із системою експресії білків у клітинах пекарських дріжджів, метилотрофні дріжджі зручніші в кількох відношеннях:

• існують добре розроблені методи отримання біомаси клітин високої густини – до 125–150 г сухої маси на літр середовища у випадку P. pastoris

і 100–130 г/л – для H. polymorpha;

• клоновано високоефективні промотори низки генів, які або регулюються метанолом (промотори генів алкогольоксидази і форміатдегідрогенази), або є конститутивними (промотор гена гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази P. pastoris;

• немає гіперглікозилювання білків;

• доступність експресійних систем на основі метилотрофних дріжджів P. pastoris у формі комерційних наборів. Система експресії на основі клітин P. pastoris успішно використана для отримання більше 100 практично

важливих білків, причому продуктивність синтезу цільового продукту надзвичайно висока – до 12 г/л.