1.3. Методи тривалого зберігання мікроорганізмів

1.3.1. Ліофілізація (висушування). Висушування із замороженого стану, або ліофілізація, є одним з найбільш економічних та ефективних методів тривалого зберігання бактерій та інших мікроорганізмів. При його використанні багато фізіологічно різнорідних видів бактерій і бактеріофагів вдається зберігати в життєздатному стані 30 років і більше. Цим методом бактерії можна зберігати невеликими порціями в ампулах.

Ліофілізація полягає у видаленні води з заморожених суспензій бактерій шляхом сублімації при низькому тиску, тобто при цьому вода випаровується, минаючи рідку фазу. Висушені клітини зберігаються досить довго, якщо захистити їх від дії кисню, вологи і світла. У будь-який момент клітини можна перевести в гідратований початковий стан. Ліофілізацію проводять різними способами за допомогою різних приладів.

Обладнання. Для ліофілізації існує як просте і недороге устаткування, що включає систему ексикатора з вакуумним насосом, так і досить складне, яке є дороговартісним. Відтворюваність і збереження культур залежать від використовуваної системи. Однак часто дуже хороші результати можна отримати за допомогою простої системи, що складається з високовакуумного насосу, конденсора і камери, або розподільної гребінки.

Ампули. Існують ампули самої різної форми і розмірів; частіше інших для ліофілізації використовуються два основних типи . Для клітин, що ліофілізують в камері, рекомендуються подвійні ампули. Такими ампулами легше користуватися, при їх використанні зменшується ймовірність інфікування сторонніми мікроорганізмами і такі ампули є більш надійні для зберігання патогенних штамів, ніж звичайні одинарні ампули, які сушать і закривають безпосередньо перед вставлянням у гребінку.

Підготовка культури. Успіх ліофілізації залежить від якості використовуваних клітин, від того, наскільки вони життєздатні і в яких умовах вони виросли. Вирощують культуру клітин так, щоб в суспензії містилося не менше 10⁸ клітин/мл. Клітини збирають у період максимальної стабільності і життєздатності культури, тобто в пізній експоненційній або ранній стаціонарній фазах росту.

Кріопротектори. Для підготовки клітин до ліофілізації їх суспендують в середовищі, що містить кріопротектор . У якості кріопротекторів використовують 24 % розчин сахарози, розведений рівним об'ємом поживного середовища (кінцева концентрація сахарози 12 % при використанні одинарних ампул) або декстран (10% ), кінську сироватку, інозит та ін.

У разі використання подвійних ампул застосовують наступну процедуру. Готують 20 % зняте молоко і стерилізують його порціями (по 5 мл) упродовж 20 хв при 116 ° С. У стерильних умовах збирають клітини, які виросли на поверхні

16

агару, змиваючи їх 20 %-ним знятим молоком. Клітини, вирощені в рідкій культурі, відокремлюють в стерильних умовах і потім суспендують осад у стерильному молоці, так щоб вийшла суспензія, що містить щонайменше 10⁶ кл/мл. Цю ж процедуру застосовують і в тому випадку, коли в якості кріопротектору використовується сахароза.

У кожну подвійну ампулу наливають 0,2 мл суспензії клітин, закривають їх ватними пробками і підрівнюють пробки ножицями. Після приготування суспензії її слід розливати по ампулам якомога швидше. Інтервал між розливом і процесом ліофілізації має бути зведений до мінімуму, щоб уникнути змін у культурі.

При використанні одинарних ампул в кожну з них наливають 0,1 мл суспензії бактерій. Вставляють ватні пробки приблизно на 1,3 см нижче краю ампули і обпалюють їх верхню частину, щоб прибрати зайві волокна вати.

Зберігання. Культури, ліофілізовані як у подвійних, так і в одинарних ампулах, зберігають при температурі нижче +5 °С. При кімнатній температурі ліофілізовані культури зберігати не можна .

Відновлення культур з ліофілізованих клітин. Сильно нагрівають запаяний кінець зовнішньої ампули на пальнику і швидко капають на нього 1-2 краплі води, щоб гаряче скло тріснуло. Обережно , але швидко пінцетом надламують і видаляють верхівку, а потім витягують пробку зі скловолокна і виймають внутрішню ампулу. З останньої акуратно видаляють ватну пробку, намагаючись не допустити забруднення культури зовнішніми волокнами.

Перш ніж відкрити одинарні ампули, їх надрізають тригранною пилочкою на відстані близько 2,5 см від верхнього кінця, а потім дезінфікують, протираючи шматочком марлі, просоченої 70 %-ним спиртом. Обгортають ампулу стерильною марлею і обламують надпиленний кінець. Зазвичай це роблять у витяжній шафі, а

у разі патогенних бактерій – у спеціальному закритому боксі. Перед тим як внести

• ампулу рідке середовище, обламаний кінець злегка обпалюють. Деякі дослідники використовують вольфрамовую голку, нагріту в киснево-газовому пальнику. Такою голкою їм вдається зробити у верхній частині ампули маленький отвір. Це забезпечує більш повільне проникнення повітря в ампулу і стерильність простору навколо отвору. Рідке середовище вносять в ампулу стерильним шприцом з голкою і витягують суспензію бактерій ним же.

Ліофілізовану культуру переводять в суспензію відразу після відкриття ампул, додаючи в кожну 0,3 – 0,4 мл відповідного стерильного рідкого середовища. Суспензію в ампулах добре перемішують і переносять у пробірки з 5 мл рідкого середовища. Після ретельного перемішування відбирають 0,2 мл суспензії та наносять на щільне або напіврідке середовище того ж складу. Необхідно перевіряти чистоту культури до ліофілізації і після неї. Для цього суспензію клітин стерильно розводять і роблять посів штрихом на щільні середовища. Пробірки та чашки з середовищем інкубують при оптимальній для бактерій температурі і, як тільки починається їх ріст, роблять пересів на свіже середовище, щоб переконатися в чистоті культури. Ріст бактерій, що піддавалися ліофілізації, часто починається після тривалої лаг-фази. Тому не можна робити висновок про загибель культури , якщо інкубація була недостатньо тривалою.

17

Перевірка життєздатності бактерій. Щоб визначити, наскільки ефективний процес висушування бактерій в замороженому стані, перевіряють їх життєздатність як до, так і після ліофілізації. Крім того, слід проводити періодичні перевірки, що підтверджують життєздатність зберігаємих ліофілізованих культур. Їх бажано також перевіряти на випадок появи будь-яких змін у властивостях бактерій в результаті їх заморожування – висушування або тривалого зберігання.

1.3.2. Ультразаморожування. Деякі види бактерій, що не піддаються ліофілізації, вдається довгостроково зберігати в замороженому стані при температурі рідкого азоту (–196 °С) або в його парах (–150 °С) в добре ізольованих резервуарах. Таким способом можна успішно зберігати безліч «вибагливих» бактерій, які не втрачають при цьому своїх фенотипових властивостей упродовж 15 років.

Бактеріальні культури можна також досить тривало зберігати в морозильниках з дуже низькими температурами (при –70 ° С). Такий метод зберігання цілком придатний для багатьох бактерій . Однак при цьому необхідно пам'ятати, що іноді вимикається електроживлення мережі або виходить з ладу компресор. У таких випадках втрату цінних колекцій допомагають запобігти сигнали попередження, а також запасні морозильники або електричні генератори. Наявні в даний час у продажу морозильники зазвичай обладнані аварійною сигнальною системою, що працює на акумуляторі.

Рекомендується також використання додаткових систем попередження, таких, як звуковий , чутливий до відключення напруги датчик температури, що працює в інтервалі від – 75°С до 200°С ( ± 0,3°С). Він працює від акумулятора і може бути закріплений на стіні.

Зберігання в рідкому азоті. Вважається, що використання рідкого азоту для тривалого зберігання мікроорганізмів обходиться дуже дорого. Однак дані останніх років про успішне зберігання в рідкому азоті фізіологічно різнорідних бактерій свідчать про те, що його використання є рентабельним, незважаючи на високу вартість.

Нині випускається ряд холодильників, що працюють на рідкому азоті, різної конструкції і ємності, наприклад типу MVE, Cryogenics, Linde, Union Carbide Corp. Їх місткість варіює від 10 до 1000 л і в них можна зберігати від 300 до 40 000 ампул з культурами клітин.

Ампули. Випускаються різні види ампул для зберігання бактерій в рідкому азоті. Особливо широко використовуються такі типи: боросилікатні з товстими стінками та спеціальні широкогорлі ампули. Ці ампули ємністю 1,2 мл мають вдавлення, що полегшують їх відкривання. Замість скляних ампул можна використовувати попередньо простерилізовані поліпропіленові пробірки з загвинчуємими кришками і силіконовими прокладками.

Кріопротектори. При зберіганні бактерій в рідкому азоті застосовують кріопротектори двох типів. До першого належать гліцерин і диметилсульфоксид (ДМСО), які легко проходять через клітинну мембрану і забезпечують як внутрішньоклітинний , так і позаклітинний захист від заморожування. До другого виду кріопротекторів відносяться такі речовини, як сахароза, лактоза, глюкоза,

18

маніт, сорбіт, декстран, полівінілпіролідон і полігліколь, які забезпечують захисну дію на зовнішній поверхні клітинної мембрани. Протектори першого типу, тобто гліцерин і ДМСО, виявилися більш ефективними і придатними для широкого кола бактерій. Вибір кріопротектора залежить від виду бактерій. При заморожуванні нових штамів слід попередньо перевірити дію на них кріопротектора.

Гліцерин і ДМСО зазвичай додають у середовище вирощування у об’ємній частці 10 і 5 % відповідно. Гліцерин стерилізують автоклавуванням 15 хв при 104 Па.

Стерилізацію ДМСО здійснюють фільтруванням, використовуючи пористі свічки Села з розміром пор 03. ДМСО збирають порціями по 10-15 мл в стерильні пробірки і зберігають у замороженому стані при 5° С (ДМСО замерзає при 18 °С). Через накопичення продуктів окисного розпаду ДМСО у відкритих бутлях зберігають не більше 1 місяця.

Підготовка культури. У виживанні бактерій після заморожування рідким азотом важливу роль відіграє фізіологічний стан культури. В основному в замороженому стані зберігають культури клітини, зібрані у середині або в кінці експоненційної фази росту.

Клітини вирощують у відповідному середовищі. У разі рідких культур клітини відокремлюють у стерильних умовах центрифугуванням і ресуспендують осад у стерильному свіжому середовищі, що містить або 10 % гліцерину (готують додаванням 20 %-ного гліцерину до рівного об'єму стерильного середовища), або 5% за об’ємом ДМСО (приготованого додаванням відповідної кількості 100% ДМСО до стерильного середовища). У разі вирощування культур клітин на агаризованому середовищі , клітини змивають з його поверхні стерильним рідким середовищем, що містить відповідний кріопротектор, і розливають у стерильні марковані ампули по 0,4 мл суспензії, що містить не менше 10⁸ клітин/мл.

Якщо штам є патогенним, ватяну пробку зрізають на рівні верхнього кінця ампули і зберігають ампули в парах рідкого азоту незапаяними. Це роблять, щоб уникнути нещасних випадків у процесі їх запаювання або щоб уникнути розриву ампули в процесі відтаювання (через потрапляння в ампулу рідкого азоту через дрібні отвори і подальшого швидкого виходу газу при кімнатній температурі).

У разі непатогенних бактерій ампулу охолоджують при 4°С не менше 30 хв. Потім нагрівають над місцем кругової насічки (надрізом) скла, обертаючи в полум'ї упродовж декількох секун , щоб видалити вологу. Ця процедура дозволяє уникнути збільшення тиску всередині ампули, яке може призвести до появи бульбашок в процесі її запаювання. Перед заповненням з ампули знімають ватну пробку. Бажано запаювати ампули за допомогою обладнаного киснево-газовим пальником напівавтоматичного пристрою, призначеного для витягування й запаювання скла. Вважається, що в цьому випадку гарантується мінімум дрібних капілярних пор. Обережно пінцетом гарячу ампулу ставлять у штатив, занурений в баню з холодною водою, з таким розрахунком, щоб вона була занурена на глибину 0,6 см. Не можна допускати попадання води на гарячу частину ампули, інакше скло може тріснути. Після охолодження ампули готові до заморожування. Якщо всі операції були виконані задовільно, температура вмісту в ампулах не повинна підніматися вище 25°С. За відсутності автоматичного пристрою ампули

19

запаюють вручну на газовому пальнику, але їх необхідно при цьому перевіряти на герметичність. З цією метою ампули після запаювання залишають на 30 хв при 5°С в 0,05 %-ному розчині метиленового синього. Погано запаяні ампули виявляють за проникненням в них фарби.

Заморожування. На сьогодні опубліковано багато робіт про вплив швидкості охолодження в процесі заморожування на виживання бактерій. Найкращі результати з виживання та відновлення бактеріальних культур були отримані в разі повільного охолодження клітин, наприклад, зі швидкістю 1°С/хв .

Відтаювання. При витягуванні заморожених скляних ампул з рідкого азоту не виключена можливість їх вибуху, тому під час цієї процедури слід надягати рукавички і захищати екраном обличчя. Щоб оживити заморожені культури, їх швидко розморожують у водяній бані при 37°С і слабкому струшуванні, поки не розтане весь лід. У разі скляних ампул для цього зазвичай потрібно 40-60 с, а в разі поліпропіленових – 60-120 с. Відразу ж після відтаювання ампулу витягують з водяної бані і дезинфікують її 70 %-ним етанолом. Ампулу розкривають і в стерильних умовах переносять культуру в свіже середовище. Для визначення ефективності методу зберігання в разі кожного штаму перевіряють життєздатність культури. Передбачуваний час виживання різних бактерій наведено у табл. 1.1.