3.2. Виділення гібридів мікроорганізмів

Для виконання роботи використовують культури аденинзалежних мутантів дріжджів S. cerevisiae (вони несуть неалельні мутації аденинзалежності ade1 і аdе2), які мають забарвлені колонії (ефект тих самих мутацій): штам S. cerevisiae a ade2 ADE1 ALC4 – червоні, а штам α ADE2 ade1 alc4 – руді. Мутація аlс 4, головним проявом якої є дихальна недостатність, змінює забарвлення колонії з червоного на рудий.

Гібрид, отриманий від схрещування цих штамів, може бути відібраний на мінімальному середовищі без аденіну. Він буде мати генотип aα ADE1 ade1 ADE2 ade2 ALC4 alc4.

Мутації ade1 і ade2 є комплементарними одна одній.

Одержання гібридних аскоспор і розсів отриманих аскоспор на чашки.

Аскоспори, утворені таким гібридом, мають такі генотипи:

a	ade1	ade2	alc4	α	ade1	Ade2	alc4
a	ade1	ade2	ALC4	α	ade1	Ade2	ALC4
a	ade1	ADE2	alc4	α	ade1	ADE2	alc4
a	ade1	ADE2	ALC4	α	ade1	ADE2	ALC4
a	ade1	ade2	alc4	α	ADE1	Ade2	alc4
a	ADE1	ade2	ALC4	α	ADE1	Ade2	ALC4
a	ADE1	ADE2	alc4	α	ADE1	ADE2	alc4
a	ADE1	ADE2	ALC4	α	ADE1	ADE2	ALC4

Примітка. До риски розміщено генотипи аскоспор, що утворюють забарвлені колонії, нижче риски – білі, як і вихідний гібрид.

Після розсіву суспензії аскоспор можна врахувати розщеплення за мутацією а lс4, що проявляється в модифікації забарвлення, тобто врахувати генотипи ALC4 і alc4. Серед забарвлених колоній співвідношення червоних і рудих очікується 1:1, тобто таке ж, як спостерігалося б серед усього аскоcпорового потомства, якби ми врахували генотипи ALC4 і аlс4 не тільки серед забарвлених, а й серед безбарвних колоній.

42

Завдання на виконання

1. Готують суспензію взятих для дослідження двох штамів дріжджів S. cerevisiae, для чого вносять петлю кожної культури в пробірку з 1 мл стерильної води. Для приготування суспензії дріжджовий матеріал слід брати з типово забарвлених колоній розсіву (на чашках).

2. Стерильні чашки заливають середовищами М та П і маркують: на дні кожної чашки по склу проводять три паралельні лінії. На крайніх лініях наносять позначення батьківських штамів. Середню лінію позначають маркером, який вказує на спільний висів обох батьківських культур. Після маркування чашок із пробірок петлею відбирають частину приготовленої суспензії й висівають по крайньому й середньому штрихом, потім іншу суспензію висівають по іншому крайньому штриху й середньому штриху поверх іншої культури. Засіяні чашки вміщують у переверненому виді в термостат при температурі 30 ± 1 °С. Період вирощування – 7 діб.

2. Проводять аналіз вирослої культури за штрихами на двох середовищах: із середнього штриха вирослої гібридної культури на середовищі М петлею проводять пересівання дріжджів на чашки із середовищем П. Висів слід робити виснажуючим штрихом. Чашки в переверненому вигляді поміщають у термостат при температурі 30 ± 1 °С на чотири доби.

4. Розглядають ріст гібрида на чашках. Переносять клітини гібриду на середовище з ацетатом, беручи їх з окремих великих білих колоній. Матеріал (стільки, скільки утримається на краю петлі) розподіляють по поверхні

середовища з ацетатом на площі 5 × 10 мм. Чашки із висівом дріжджових гібридів вміщують у термостат з температурою 30 ± 1 °С на 2 – 3 доби.

Опрацювання результатів

1. З вирослої на зазначеній площі ацетатного середовища культури петлею збирають клітини гібриду й переносять у пробірку з 0,5 мл травного соку равликів. Культуру збовтують і залишають у спокої на 2 – 3 год при кімнатній температурі. Після закінченні цього часу у пробірку додають 4 мл стерильної дистильовані води. Суспензію ретельно збовтують.

2. Для одержання суспензії з концентрацією дріжджових клітин 5000 і 1000 клітин/мл проводять розведення, для чого на початку визначають вміст спор у суспензії підрахунком їх у камері Горяєва, а потім розводять до потрібної концентрації, додаючи 0,5 мл суспензії до 4,5 мл стерильної води. Із двох останніх розведень проводять висів на чашки із середовищем П, наносячи на поверхню 0,1 мл суспензії з наступним розтиранням її шпателем. Засіяні чашки в переверненому вигляді вміщують у термостат з температурою 30 ± 1 °С на сім діб.

3. Для гібридологічного аналізу на чашках підраховують кількість колоній червоного і рудого кольору (оптимальна густина висіву 200 колоній на чашку).

Отримані результати обробляють за критерієм χ² (ксі-квадрат) за допомогою формули:

43

_{χ 2 =} (A− 0,5N)² + (B − 0,5N)² _; 0,5N

де N – загальна кількість забарвлених колоній, А – кількість червоних колоній, В – кількість рудих колоній.

Якщо знайдене значення менше 3,84, то теоретично різниця між отриманим і очікуваним співвідношеннями недостовірна, тобто спостерігається багатогенне розщеплення.

І заповнюють таблицю, складену за таким зразком:

Чашка			Кількість забарвлених колоній
			всього	червоних	рудих
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Знайдене		Кількість	N	А	B
очікування		колоній
χ2			N	0,5 N	0,5 N

Контрольні запитання

1. Що являє собою гібридна клітина з точки зору біологічного об'єкта і молекулярної організації?

2. Які основні методи гібридизації клітин? В чому полягає суть гібридизації?

3. Що означають терміни „генотип” і „фенотип”?

4. Що таке рецесивність і домінантність ознаки у клітин мікроорганізмів?

5. Які існують методи аналізу гібридних клонів?

Література: [2, 4, 6].

44

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ 4

МУТАГЕНЕЗ У МІКРООРГАНІЗМІВ Мета: вивчення дії фізичних та хімічних факторів одержання мутантів;

опанування методів статистичного опрацювання результатів індукованого мутагенезу.

Матеріали та обладнання: бактерицидна лампа БУВ-30П; 0,5 М розчин нітриту натрію; чашки Петрі з сусло-агаром; чашки діаметром 40 – 50 мм для опромінення; камера Горяєва; пробірки з 0,8; 1,6; 2,4; 4,9 мл води; пробірка з 0,9 мл води, з 0,9 та 4,5 мл фосфатного буфера (рН 8,0); пробірки з 8 мл ацетатного буфера (рН 4,4); стерильні пробірки і піпетки; прототрофний гаплоїдний штам дріжджів S. cerevisiae 15В-ПЧ.

Загальні відомості Мутаційна мінливість або мутація − це стрибкоподібна зміна генетичного

матеріалу під впливом факторів зовнішнього чи внутрішнього середовища, що передається нащадкам.