1.2. Методи нетривалого зберігання мікроорганізмів

1.2.1. Субкультивування. Традиційним методом зберігання бактеріальних культур є їх періодичні пересіви на свіжі середовища. Інтервал меж пересіву залежить від мікроорганізму, використовуваного середовища і зовнішніх умов. Деякі бактерії слід пересівати через день, інші – тільки через кілька тижнів або місяців. При використанні цього методу для зберігання культур повинні бути дотримані три умови:

• відповідне підтримуюче середовище;

• ідеальна температура зберігання;

• необхідна частота пересівань.

Підтримуюче середовище. Переважно використовують мінімальні середовища , оскільки в них процеси метаболізму в мікроорганізмах йдуть із зниженими швидкостями і тому проміжки між пересівами подовжуються. Однак для росту деяких бактерій потрібні комплексні середовища, або ж для збереження їх специфічних фізіологічних властивостей необхідною є присутність в середовищі складних сполук. При використанні комплексного середовища можуть знадобитися більш часті пересівання, пов'язані з прискореним ростом бактерій або накопиченням кінцевого продукту метаболізму.

13

Зберігання. Найпростішим способом є зберігання культур мікроорганізмів при кімнатній температурі в штативі або в спеціально сконструйованому для зберігання боксі, в якому є полиці з отворами для пробірок. При такому зберіганні культур необхідний постійний контроль, оскільки вони мають тенденцію швидко висихати, і якщо умови в лабораторії не регулюються , то культури погано переносять температурні коливання. Для зменшення висихання культур використовують загвинчувальні кришки з гумовими прокладками, обгортають верхню частину пробірок парафільмом або поміщають пробірки в пластмасовий мішок. Щоб зменшити швидкість метаболізму, культури зберігають у холодильнику при 5–8 °С. Використовуючи ці запобіжні заходи, можна зберігати більшість бактерій упродовж 3–5 місяців без пересіву.

Режим пересівання. Частоту пересівань (субкультивування) визначають експериментальним шляхом. Субкультивування слід проводити якомога рідше, щоб уникнути селекції варіантів. На випадок втрати культури бажано зберігати дублікати пробірок з нею. Після кожного пересіву культуру перевіряють на чистоту і періодично проводять скорочену перевірку для виявлення будь-яких змін в фенотипових властивостях бактерій. У пересіваємих культурах не слід виділяти поодинокі колонії, оскільки при цьому підвищується вірогідність селекції мутантів.

Основними недоліками методу періодичного пересіву є: ризик зараження, помилки при позначенні штамів або наклеюванні неправильної етикетки, селекція варіантів або мутантів, можлива втрата культур і необхідність виділення спеціального місця для їх зберігання.

1.2.2. Зберігання під мінеральним маслом. Багато видів бактерій успішно зберігають місяцями або навіть роками за допомогою порівняно простого і дешевого методу, а саме під шаром стерильного медичного мінерального масла (можна використовувати вазелінове масло з питомою щільністю 0,865–0,890). Однак через недостатню стерильність мінерального масла при використанні цього методу може відбуватися зараження культур.

Масло стерилізують у сушильній шафі при 170 °С упродовж 1–2 год; автоклавування для цієї мети застосовувати не рекомендується.

Культури вирощують на скошеному агарі, в стовпчиках агару або в рідкому середовищі відповідного складу. Після появи досить гарного росту в пробірку в стерильних умовах наливають шар мінерального масла висотою не менше 2 см (культура клітин на скошеному агарі повинна бути повністю покритою) для захисту від висихання, а також для зменшення метаболічної активності і уповільнення росту культур.

Вкриті маслом культури зберігають у вертикальному положенні в холодильнику. Для перевірки збереження культур періодично визначають їх життєздатність.

Культуру під маслом можна пересівати на свіже середовище за допомогою інокуляційної голки, а отриману культуру можна знову покривати стерильним маслом. При випалюванні голки слід подбати про те, щоб бризки масла не потрапили на навколишні предмети і персонал. Первинну культуру зберігають не

14

менше кількох тижнів на той випадок, якщо субкультура виявиться забрудненою або бактерії в ній матимуть змінені властивості.

Цьому методу притаманні такі ж недоліки , як і звичайному субкультивуванню. Крім того, слід пам'ятати про можливе забруднення масла.

1.2.3. Заморожування і висушування. Зберігання бактерій в морозильній камері холодильника або звичайному морозильнику при температурі від 0° до

–20 °С призводить до різних наслідків залежно від виду бактерій. В принципі, такий спосіб зберігання не рекомендується через пошкодження клітин в евтектичних сумішах концентрованих розчинів електролітів (наприклад, в такій суміші NaCl має евтектичну точку –20 °С). Разом з тим деякі бактерії при заморожуванні можна зберігати від 6 міс до 2 років.

Більшість культур гине при висиханні в лабораторних умовах. Однак деякі культури, особливо спороутворюючих бактерій, можна зберігати роками, якщо висушувати їх у відповідному середовищі.

Ґрунт. Спороутворюючі бактерії можна успішно зберігати роками у стерильному ґрунті, висушеному на повітрі. Ґрунт стерилізують автоклавуванням по кілька годин упродовж двох днів. Інокулят з суспензії спор (по 1 мл ) вносять у пробірки, що містять стерильний ґрунт, і залишають при кімнатній температурі до помітного висихання . Потім пробірки закривають стерильними гумовими пробками і зберігають у холодильнику.

Папір. Порівняно простим і недорогим способом зберігання бактерій є їх висушування на смужках або дисках стерильного фільтрувального паперу. Цей метод ідеальний для забезпечення контролю за якістю культур . У загальній пробірці або у банці з кришкою можна зберігати багато дисків, що містять одну і ту ж культуру. При необхідності диск дістають стерильним пінцетом і в стерильних умовах вносять його у відповідне рідке середовище. Представників родини Enterobacteriaceae, а також багато інших бактерії можна зберігати на папері упродовж декількох років. Техніка цього методу полягає в наступному: стерильний папір просочують суспензією бактерій, що містить щонайменше 10⁸ клітин/мл, і висушують на повітрі або під вакуумом. Бактерії краще виживають при висушуванні під вакуумом. Смужки або диски паперу зберігають у закритих пробірках. Якщо дані пробірки помістити в холодильник, то термін життя культури подовжується.

Желатина. Багато гетеротрофних бактерій можна зберігати у висушених краплях або дисках желатини. Зазвичай у такому вигляді бактерії краще зберігаються при температурі –20 °С, н іж при +4 °С або при кімнатній температурі . Желатинові культури готують наступним чином. Культури вирощують у відповідних середовищах і клітини отримують центрифугуванням в стерильних умовах. Осад клітин ресуспендують в малій кількості рідкого середовища, переносять у пробірку з 2-5 мл розплавленої харчової желатини і інкубують при 30 °С до досягнення щільності 10⁸-10¹⁰ клітин/мл. Потім за допомогою стерильної пастерівської піпетки або шприца вводять краплю бактеріальної суспензії на дно стерильної пластмасової чашки Петрі. Чашку Петрі поміщають в ексикатор, що містить п’ятиоксид фосфору, і відкачують з нього повітря вакуумним насосом. Після того як краплі желатини висохнуть, їх

15

переносять з дотриманням правил асептики в стерильні пробірки з кришками і зберігають у холодильнику. Культуру бактерій отримують після перенесення желатинової краплі в стерильних умовах у пробірки, що містять відповідні середовища.