МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

ЗАТВЕРДЖУЮ Ректор ____________ С.В. Іванов

(Підпис)

____ ____________ 2014 р.

ГЕНЕТИКА

ЛАБОРАТОРНИЙ ПРАКТИКУМ

для студентів напряму підготовки 6.051401 «Біотехнологія» денної форми навчання

Всі цитати, цифровий та фактичний					СХВАЛЕНО
матеріал,			бібліографічні	відомості	на засіданні кафедри
перевірені.			Написання	одиниць	біотехнології і мікробіології
відповідає стандартам					Протокол № 12
Підпис(и)					від 20.03.2014 р.
автора(ів)________________
«	»			2014 р.

Реєстраційний номер електронного лабораторного практикуму у НМВ

69.41 – 02.06.2014

КИЇВ НУХТ 2014

2

Генетика [Електронний ресурс]: лабораторний практикум для студентів напряму підготовки 6.051401 «Біотехнологія» денної форми навчання / уклад.: О.І. Скроцька. – К.: НУХТ, 2014. – 78 с.

Рецензент О.В. Карпов, д-р біол. наук

О.І. СКРОЦЬКА, канд. біол. наук

Подано в авторській редакції

© О.І. Скроцька, 2014 © НУХТ, 2014

3

		ЗМІСТ
Зміст …………………………………………....…………………...…………					3
Загальні правила безпеки при виконанні робіт у мікробіологічній
лабораторії …………….....................................………………..………......					4
Організація занять ……………………………………………….…………..					9
Лабораторне заняття 1. Загальні правила роботи			з	бактеріями і
	бактеріофагами …………………….……..……...				10
Лабораторне заняття 2. Цитоплазматична спадковість у дріжджів .........					31
Лабораторне заняття 3. Одержання		гібридів	і	принципи
	гібридологічного аналізу ………………….……				40
Лабораторне заняття 4. Мутагенез у мікроорганізмів ………….………..					44
Лабораторне заняття 5.	Відбір та ідентифікація біохімічних мутантів …..				54
Лабораторне заняття 6.	Флуктуаційний тест Лурія й Дельбрюка ……….				59
Лабораторне заняття 7.	Генетичне картування прокаріот ………….…….				64
Лабораторне заняття 8.	МетодивиділенняДНКізклітин
	мікроорганізмів …………………………….……..				70
РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА ………………..…….…………………					78

4

ЗАГАЛЬНІ ПРАВИЛА БЕЗПЕКИ ПРИ ВИКОНАННІ РОБІТ У

МІКРОБІОЛОГІЧНІЙ ЛАБОРАТОРІЇ

При роботі у мікробіологічній лабораторії слід суворо дотримуватись вимог, викладених у інструкції з техніки безпеки. У разі, якщо студент не ознайомлений з зазначеними вимогами, він повинен повідомити про це викладача. Студент несе персональну відповідальність за власну безпеку під час перебування у лабораторії, що підтверджує підписом у журналі з техніки безпеки при проведенні інструктажу.

Перед початком кожної лабораторної роботи студент повинен ознайомитись з особливостями техніки безпеки при проведенні лабораторної роботи та поставити свій підпис у журналі.

До роботи не допускаються студенти , які мають пошкодження на відкритих ділянках шкіри не оброблені та не заклеєні бактерицидним пластиром.

Кожен студент працює на постійному місці та виконує завдання індивідуально. На робочому місці потрібно підтримувати зразковий порядок. Особисті речі повинні зберігатися в спеціально відведеному місці. Перед початком роботи слід одягти білий бавовняний халат та застебнути його на всі ґудзики . У халаті забороняється знаходитись за межами лабораторних приміщень, а також надівати на халат верхній одяг. Волосся необхідно прибрати з обличчя та сховати під шапочку. При роботі в лабораторії бажано знаходитися без косметики на обличчі та з коротко остриженими нігтями.

На робочому столі повинні знаходитися тільки предмети, необхідні для проведення мікробіологічних досліджень: спиртівка, пастерівські та градуйовані піпетки, пінцети, бактеріологічні петлі, шпателі , предметні та накривні скельця, пробірки, штативи, чашки Петрі, мікроскоп. На робочому місці не повинно бути сторонніх предметів (верхнього одягу, халатів, у тому числі портфелів і сумок)

Під час виконання лабораторної роботи не можна відкривати кватирки. Необхідно дотримуватися тиші, уникати зайвого руху і ходіння, відкривання і закривання дверей – всього того , що підсилює рух повітря. Виконання цих вимог запобігає прониканню сторонніх мікроорганізмів із повітря і ротової порожнини в досліджуваний матеріал.

На вході до лабораторних приміщень, де проводять біологічні дослідження встановлюють знак біологічної небезпеки та додаткову інформацію щодо відповідальних осіб. Недотримання умов ведення дослідів або порушення послідовності виконання роботи може призвести до зміни характеру кінцевих результатів, а сам хід досліджень стане неконтрольованим.

Необхідно пам’ятати, що в лабораторних роботах можуть бути використані речовини, що активно впливають на генетичний апарат клітини. Тому з цими речовинами слід поводитися обережно. Не слід допускати їх потрапляння будь-яким чином на шкірні покриви.

Роботу у мікробіологічному боксі дозволено проводити лише за проходження додаткового інструктажу з техніки безпеки, наявності відповідного захисного одягу (халат, шапочка, захисна маска та захисні окуляри).

5

При роботі зі скляними предметами необхідно дотримуватись наступних вимог:

• при закриванні колби, пробірки або іншої тонкостінної посудини пробкою, тримати посудину за верхню частину шийки ближче до місця, куди повинна бути вставлена пробка, захищаючи руку рушником;

• при нагріванні пробірок над полум’ям користуватися тримачами;

• при вставленні скляних трубок у гумові пробки або шланги (при складанні приладів) попередньо змочують зовні скляну трубку і внутрішні краї шлангу або отвір у пробці водою, гліцерином або вазеліновою олією;

• при вставленні скляних трубок або термометра в просвердлену пробку, останню не впирають в долоню, а тримають за бічні сторони. Трубку або термометр тримають якнайближче до кінця, що вставляється в пробку;

• нагріту посудину не можна закривати притертою пробкою поки вона не охолоне;

• нагріваючи рідину в пробірці або інших посудинах їх тримають спеціальними утримувачами так, щоб отвір був спрямований від себе і працюючих поруч;

• при перенесенні посудин із гарячою рідиною користуються рушником, посудину при цьому тримають обома руками: однією за дно, а другою за горловину;

• великі хімічні склянки з рідиною піднімають тільки двома руками так, щоб відігнуті краї стакана спиралися на вказівні пальці;

• при закупорюванні пробками посудин із реактивами враховують їх властивості. Гумові пробки сильно набухають під дією деяких реактивів (спирт, бензол, ацетон, ефір), а під дією галогенів (бром, йод) втрачають еластичність. Такі реактиви краще закупорювати скляними притертими пробками. Луги не можна закупорювати притертою пробкою, тому що карбонати, що утворюються між пробкою і горлом, щільно заклинюють пробку;

• при переливанні рідин (крім тих, що містять біологічний матеріал) користуються лійкою;

• при змішуванні (розведенні) речовин, що супроводжуються виділенням тепла, користуються термостійким хімічним посудом;

• нагрівання сильнодіючих отруйних речовин проводять тільки в круглодонних колбах і не на відкритому вогні;

При роботі з живими культурами мікроорганізмами необхідно дотримуватись таких вимог:

• працюють з мікроорганізмами користуючись інструментом (петлею, пінцетом, ножицями тощо). Забороняється торкатися досліджуваного матеріалу руками;

• перед використанням посуд, піпетки, обладнання тощо повинні бути перевіренні на цілісність і справність;

• усі технічні маніпуляції проводять таким чином, щоб уникнути виникнення аерозолів;

6

• пробки матраців, флаконів, пробірок відкривають тільки над полум’ям пальника. Суспензію мікроорганізмів вносять в посудину так, щоб не торкатись горловини посудини. Краї отворів посудин прожарюють над полум’ям пальника і закривають пробками. Забороняється переливання рідких культур і матеріалу, що досліджується;

• при піпетуванні користуються піпетками або дозаторами. Кінець піпетки завжди повинен бути нижче рівня рідини в посудині або рідина з піпетки повинна стікати по внутрішній стінці посудини;

• обов’язкова наявність ватної пробки у тупому кінці піпетки та ватно-марлевих корків у пробірках;

• центрифугування проводиться спеціально підготовленим персоналом. Якщо в процесі центрифугування розбивається пробірка, що містила суспензію мікроорганізмів, центрифугу відключають від мережі, знезаражують і очищають забруднені місця;

• всі роботи, що можуть супроводжуватися випадковими прямими контактами з мікроорганізмами виконують у гумових рукавичках;

• роботу з культурами мікроміцетів можна проводити лише за наявності індивідуальних засобів захисту дихальних шляхів;

• оскільки деякі мікроорганізми, особливо спори грибів, є алергенами, не допускається їх розпилення, тому не можна залишати відкритими чашки Петрі, пробірки, колби з культурами мікроорганізмів;

• у разі випадкового потрапляння мікробного матеріалу на шкіру або стіл чи підлогу та інші поверхні слід негайно повідомити про це викладача і в його присутності провести дезінфекцію заражених ділянок, потім обробити руки дезрозчином і ретельно вимити їх з милом;

• всі предмети, використані у роботі з живими мікроорганізмами, мають бути знезаражені фламбуванням (петлі, голки), кип’ятінням (пробірки, чашки Петрі), обробленням дезінфікуючими розчинами (шпателі, піпетки, предметні й покривні скельця).

При роботі з кислотами та лугами виконують такі заходи безпеки:

• всю роботу з концентрованими кислотами та лугами проводять під витяжною шафою, використовуючи при цьому засоби індивідуального захисту (рукавички, респіратори, гумовий фартух, захисні окуляри);

• концентровану кислоту відбирають із посудини тільки за допомогою спеціальної піпетки з грушою або сифоном;

• при приготуванні розчинів кислот, спочатку в посудину наливають необхідну кількість води, а потім помалу додають кислоту. Забороняється додавати воду в кислоту;

• при приготуванні розчинів лугів наважку лугу опускають у велику широкогорлу посудину, заливають необхідною кількістю води і старанно перемішують. Шматки лугу варто брати тільки щипцями. Щоб запобігти розігріванню розчину, при приготуванні розчинів лугів, посуд попередньо поміщають у водяну баню;

7

• розбивання великих шматків їдкого лугу на дрібні роблять користуючись захисними фартухом і рукавичками, у спеціально відведеному місці, при цьому розбиті шматки накривають бельтингом або іншим матеріалом;

• концентровані кислоти і луги виливають у раковину після попередньої їх нейтралізації;

• при кип’ятінні кислотних і лужних розчинів не можна щільно закривати посуд (пробірки і колби) пробкою до повного їх охолодження.

• при митті посуду хромовою сумішшю запобігають попаданню її на шкіру, одяг, взуття;

• при потраплянні будь-яких хімічних речовин на шкіру необхідно змити реактив великою кількістю води. Нейтралізувати вплив кислоти необхідно слабким розчином соди, а вплив лугу – слабким розчином оцтової кислоти.

При роботі з легкозаймистими речовинами (ефір, бензин, бензол, ацетон, спирт та ін.) дотримуються таких вимог:

• усі роботи проводяться у витяжній шафі при включеній вентиляції, вимкнутих газових пальниках і нагрівальних електроприладах відкритого типу;

• нагрівання легкозаймистих речовин проводять у витяжній шафі на піщаній або водяній бані з закритим електронагрівом;

• при випадковому займанні спирту необхідно терміново загасити його, закривши доступ повітря до ємкості, у якій він знаходиться;

• під час стерилізації лабораторних інструментів (шпателі, скальпелі, голки, петлі тощо) у розчині спирту необхідно слідкувати, щоб інструменти, що стерилізуються, були охолоджені.

Працюючи з відкритим полум’ям (газовий пальник, спиртівка), потрібно дотримуватися таких вимог:

• запалювати спиртівку та газовий пальник лише за допомогою сірника;

• забороняється запалювати спиртівку чи пальник запальничкою та іншою запаленою спиртівкою (газовим пальником);

• гасити запалену спиртівку потрібно, закривши доступ повітря спеціальним ковпачком, а газовий пальник – перекриттям доступу газу.

• розташовувати спиртівку потрібно на відстані не меншій ніж 20 см від краю робочого стола;

• запалену спиртівку заборонено пересувати з місця на місце;

• при випадковому займанні ватно-марлевого корку необхідно терміново загасити його, закривши доступ повітря;

• по закінченню роботи з газовими пальниками необхідно перевірити, що вихід газу перекрито.

8

Категорично забороняється:

• у лабораторію забороняється входити в головних уборах та верхньому одязі (куртка, пальто, плащ тощо), класти на столи портфелі та сумки;

• під час виконання лабораторної роботи категорично забороняється користуватися мобільними телефонами та залишати їх увімкненими;

• у лабораторії забороняється палити, вживати їжу та напої, зберігати продукти харчування;

• під час виконання лабораторної роботи студентам заборонено пересуватися по лабораторії без зайвої потреби. Всі рухи повинні бути спокійними та виваженими;

• під час роботи в лабораторії запалювати сірники, палити, включати прилади, при роботі яких може виникнути іскра;

• при роботі з мікроорганізмами заборонено торкатися обличчя, рота, носу та очей руками;

• заходити у бокс при увімкненій бактерицидній лампі;

• користуватися скляним посудом, що має сколи, тріщини, гострі краї;

• використовувати несправне електрообладнання і вмикати прилади без дозволу викладача або інженера, а також торкатися поверхні приладів мокрими руками;

• виносити за межі лабораторії будь-які матеріали і посуд, що використовується для проведення лабораторних робіт.

Після закінчення роботи необхідно:

• усі засіяні пробірки, чашки помістити у термостат або здати інженеру. Відпрацьований матеріал (пробірки, чашки Петрі, піпетки) поміщають в певні ємності за вказівкою інженера чи лаборанта для їх подальшої обробки;

• привести в порядок робоче місце: прилади ставлять на відведені для них місця, стіл протирають дезінфікуючим розчином;

• зняти халат, старанно вимити руки з милом, а за потреби обробити дезінфікуючим розчином; слід мати індивідуальний рушник або серветки для витирання рук.

9

ОРГАНІЗАЦІЯ ЗАНЯТЬ

На лабораторних заняттях з дисципліни «Генетика» студенти повинні мати халат та робочий зошит. Перед початком заняття студенти проходять інструктаж із правил роботи з обладнанням та техніки безпеки. До початку заняття студенти самостійно вивчають методику проведення експерименту та теоретичний матеріал, а також складають план проведення роботи та визначають кількість необхідного посуду, реактивів, середовищ та інших матеріалів. Викладач перед початком заняття перевіряє готовність студентів та допускає їх до виконання роботи. Студенти працюють індивідуально. Ті з них, хто виконує однакову роботу, можуть об’єднуватися у групи для підготовки культур мікроорганізмів до експерименту, посуду, середовищ, реактивів тощо.

На кожен експеримент у робочому зошиті студенти складають протокол. У ньому мають бути зафіксовані:

1. Дата, час початку та закінчення досліду.

2. Тема та мета заняття.

3. Назва об’єкта дослідження. Вік, генетичні маркери та інші мутації об’єкта досліджень, його морфологічні, фізіологічні, біохімічні та інші особливості.

4. Схема досліду (наприклад, схема схрещування, схема клонування ДНК тощо).

5. Титри суспензій мікроорганізмів, використаних у роботі.

6. Склад поживних середовищ, концентрації розчинів та буферних сумішей.

7. Температура, при якій були проведені досліди.

8. Режими роботи приладів.

9. Послідовність дій під час експерименту (при потребі час початку та закінчення його етапів) з обов’язковим наведенням схеми постановки експерименту та описом використаних методик дослідження.

10. Особливості досліду. Всі, навіть випадкові, відхилення від методики.

11. Первинний цифровий матеріал (покази приладів, результати підрахунку кількості колоній на чашці тощо) та розрахунки, зроблені на його основі; таблиці, графіки, побудовані за отриманими даними, інші ілюстрації (фотографії та їхні негативи).

12. Висновки, зроблені за результатами досліду.

Готовий протокол заняття перевіряється викладачем, проводиться захист виконаної роботи (усно або письмово) і студенту виставляється певна кількість балів згідно критеріїв оцінювання успішності навчальної роботи студентів за окремими елементами змістових модулів з дисципліни «Генетика».

10

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ 1

ЗАГАЛЬНІ ПРАВИЛА РОБОТИ З БАКТЕРІЯМИ І БАКТЕРІОФАГАМИ Мета: засвоєння правил пересівання та зберігання бактерій і бактеріофагів;

ознайомлення та опанування методів визначення титру бактерії й бактеріофагів. Матеріали та обладнання: термостат; чашки Петрі з повним агаризованим

середовищем; пробірки з 4,5 мл фосфатного буфера ; пробірки з 4,5 мл розведеного 0,5 % NaCl бульйону Хоттингера; пробірки з 3 мл 0,7 % повного агаризованого середовища; стерильні піпетки ; шпателі Дригальського; суспензія культури Escherichia coli концентрацією 10⁹ клітин/мл; суспензія бактеріофага Т4В концентрацією 10⁹ частинок/мл.

Загальні відомості

Мікроорганізми активно використовують як об’єкти генетичних експериментів з 40-х років XX століття. Їхній вибір був зумовлений потребою вирішення важливих проблем, які з’явилися з розвитком генетики, насамперед дослідження природи гена як матеріальної структури живої клітини та його біохімічної функції, та визначив перехід до вивчення генетичних процесів на молекулярному рівні. Мікроорганізмам властиві певні особливості, що сприяють вирішенню таких проблем:

• їх можна культивувати у строго контрольованих умовах – у поживних середовищах відомого хімічного складу, при певній температурі, аерації тощо. Це означає, що дослідник може постійно контролювати вплив умов існування організму на функціонування генів;

• мікроорганізми мають короткий життєвий цикл. Наприклад, за оптимальних умов росту час генерації (період часу між двома послідовними поділами клітини) у кишкової палички Escherichia coli становить 20–30 хв. Отже, за невеликий проміжок часу можна отримати багато поколінь нащадків певного організму. Популяції нащадків одного організму можуть становити мільйони та мільярди особин. Це важливо, бо генетичні закономірності виявляються у ряді поколінь та мають статистичний характер. Це дає змогу виявляти рідкісні генетичні зміни, наприклад, виділяти мутанти, частота яких є дуже низькою (10^-6–10^-9), виявляти рекомбінанти, що виникли у результаті внутрішньо-генного кросинговеру тощо.

• більшості мікроорганізмів одна особина – це окрема клітина. У генетиці зазвичай вивчають не окремі особини, а клонові культури мікроорганізмів (клони). Клон – це культура, що виникла у результаті нестатевого розмноження клітини. У вірусів клони – це нащадки однієї вірусної частинки. Отже, клони є групами спадково однорідних особин. Найчастіше клони отримують після посіву суспензій клітин мікроорганізмів на твердих поживних середовищах.

Окремі клітини діляться, утворюючи колонії, що і є клонами. Клони вірусів виділяють із зон лізису (негативних колоній), які виникають після посіву суспензії вірусів на газон чутливих до них культур клітин. Кожна негативна колонія утворена нащадками однієї вірусної частинки.

11

Досліджують як індивідуальні ознаки клітин мікроорганізмів, наприклад, розмір та форму клітин, особливості будови і функції їхніх органел, так і ознаки клонів. Розмір, форма, характер поверхні та забарвлення колоній, здатність культури засвоювати певні речовини як джерела живлення, чи продукувати певні речовини – це ознаки клонів. Ознаки клонів насамперед визначаються властивостями клітин, які їх утворюють. Так, наприклад, гладенькі слизисті колонії виникають завдяки здатності клітин утворювати полісахаридну капсулу. З первинного клона можна отримати вторинні клони (субклони).

Клонові ознаки зазвичай зберігаються в абсолютної більшості вторинних клонів за незмінних умов росту та розмноження. Однак у клоні можуть виникати і нагромаджуватися мутанти з новими ознаками. Тому генетична однорідність клона є відносною й тимчасовою. Клонована культура, генетична однорідність якої підтримується селекцією за певними ознаками, називається штамом.

1.1. Escherichia coli

Кишкова паличка Escherichia coli є одним з основних об’єктів генетики, молекулярної біології та генетичної інженерії. Це грамнегативна бактерія, клітини якої мають паличкоподібну форму із злегка заокругленими кінцями. Розміри: 0,4– 0,8 в ширину та 1 –3 мкм в довжину. Не утворює спор. Оптимальні умови росту: температура 30–37°С, рН 7,2–7,5. Досить добре розмножується й при кімнатній температурі. Утворює опуклі напівпрозорі колонії сіруватого кольору. Гетеротроф, факультативний анаероб, зброджує глюкозу, лактозу, мальтозу, арабінозу, галактозу, ксилозу, рамнозу та інші цукри, утворює індол та сірководень, відновлює нітрати в нітрити. Є звичайним компонентом нормальної кишкової мікрофлори людини й багатьох хребетних та безхребетних тварин.

E. coli постійно виявляють й у зовнішньому середовищі – в ґрунті, воді, на різних предметах. Деякі штами E. coli є умовно-патогенними та патогенними.

Штам E. coli K-12 виділено в 1922 році в Стенфордському університеті США. Використовуючи даний штам як вихідний, було отримано більше 3000 штамів E. coli , які використовують у генетиці, молекулярній біології та біотехнології. У генетичних дослідженнях кишкову паличку вперше використали Дж. Бідл та Е. Т ейтум. Вони вивчали генетичний контроль метаболізму, використовуючи ауксотрофні мутанти E. coli. У 1946 Дж. Ледерберг та Е. Тейтум відкрили кон ’югаційний процес у кишкової палички, що стало поштовхом для опрацювання методів генетичного аналізу цієї та інших бактерій. Саме у дослідах на Е. соli були встановлені основні закономірності таких важливих процесів, як реплікація, рекомбінація та репарація ДНК, мутагенез, транскрипція та трансляція, розшифровано генетичний код та механізми регулювання активності генів, опрацьовано принципи і методи генетичної інженерії.

У 1997 році секвеновано геном штаму E. coli К-12. До 2005 року секвеновано також геноми ще трьох патогенних штамів E. coli: 0157:Н7, 0157:Н7 ЕDL933 та CFT073. У клітинах E. coli є одна хромосома, яка містить кільцеву дволанцюгову молекулу ДНК. Розміри цієї молекули в різних штамів E. coli коливаються від 4,6 до 5,6 млн п .н. У штаму E. coli К-12 у хромосомній ДНК 4639221 п.н. У ній ідентифіковано 4288 відкритих рамок зчитування, що кодують

12

відомі та ймовірні білки , 7 оперонів генів рРНК (16S, 23S та 5S) та 86 генів тРНК. Гени білків становлять 87% геному, гени стабільних РНК – 0,8%, некодуючі послідовності, що повторюються – 0,7%, решта (≈11%) послідовностей виконують регуляторні та інші функції. Середній розмір гену – 951 п.н.

Для штамів Е. сoli властиві такі способи генетичного обміну, як кон’югація та трансдукція. Розроблено методики отримання компетентних клітин Е. сoli та їхньої трансформації екзогенною ДНК. Саме штами E. coli найчастіше використовують як реципієнти для клонування ДНК у генно-інженерних дослідах. Ці штами несуть низку мутацій, які роблять їх хорошими реципієнтами ДНК, а також обмежують здатність розмножуватися в кишковому тракті та виживати у природному сенредовищі поза контрольованими умовами лабораторії.

У більшості бактеріологічних лабораторій організовані музеї живих культур мікроорганізмів, що використовуються в процесі навчання, в дослідницьких, промислових та інших цілях. Правильне зберігання культур є надзвичайно важливою проблемою, якій слід приділяти таку ж увагу, як і стандартизації обладнання та вибору хімічних речовин. Втрата або зміна властивостей основних культур внаслідок їх неправильного зберігання завадили б виконанню багатьох наукових програм.

Основними цілями зберігання є підтримка життєдіяльності клітин і чистоти культур , а також попередження змін і мутацій, тобто збереження мікроорганізмів в стані, максимально близькому до початково виділеного штаму. Існує багато методів зберігання бактерій, проте не всі штами при використанні якого-небудь з них ведуть себе однаково. Вибір методу часто визначається наявністю обладнання, місця для зберігання і кваліфікованих співробітників.