Лабораторная работа №1 цветные реакции на белки и аминокислоты. Осаждение белков

Присутствие белка в исследуемом материале можно обнаружить с помощью цветных реакций на структурные компоненты белка и его функциональные группы. Цветные реакции на белки можно разделить на 3 типа:

1) реакции на пептидную группу;

2) реакции на концевые амино- и карбоксильные группы;

3) реакции на определенные аминокислоты в молекуле белка.

Первые 2 типа реакций дают все белки, третий тип относится к специфическим, так как обусловлен аминокислотным составом белка.

Опыт 1. Биуретовая реакция

Метод основан на способности пептидной группы белков – СО – NН - образовывать в щелочной среде с ионами меди (II) комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от количества пептидных связей (М⁺ - катион щелочного металла):

К 1 мл раствора белка добавляют 1 мл 10%-ного раствора щелочи и 1-2 капли 1%-ного раствора CuSO₄. Появляется фиолетовое окрашивание. Эту реакцию могут давать поли- и олигопептиды, но с другими оттенками окраски .

Опыт 2. Ксантопротеиновая реакция

Реакция основана на способности присутствующих в молекуле белка ароматических аминокислот (тирозина, триптофана и фенилаланина) образовывать с концентрированной азотной кислотой при нагревании нитропроизводные соединения желтого цвета.

Реакция обеспечивает появление желтого окрашивания при попадании концентрированной азотной кислоты на кожу и ногти.

К 2-3 мл раствора белка приливают 0,5 – 1 мл концентрированной HNO₃. Выпадает осадок, который при нагревании приобретает желтую окраску.

Опыт 3. Реакция Фоля (с ацетатом свинца)

Метод основан на способности белков, в состав которых входят серосодержащие аминокислоты (цистин, цистеин), в щелочной среде при нагревании образовывать сульфид натрия, который с ацетатом свинца дает черный или бурый осадок сульфида свинца:

R-SН + 2 NaOH → Na₂S + R-OH + H₂O

Na₂S + (CH₃COO)₂Pb → PbS↓ + 2 CH₃COONa

1-2 мл раствора белка кипятят 2-3 минуты с двойным объемом 10%-ного раствора NaOH, затем прибавляют 1-2 капли 5%-ного раствора ацетата свинца. Выпадает осадок сульфида свинца PbS.

Опыт 4. Нингидриновая реакция

При нагревании смеси аминокислоты с раствором нингидрина происходит распад аминокислоты с образованием углекислого газа, аммиака и соответствующего альдегида. Восстановленный нингидрин конденсируется с аммиаком и окисленной молекулой нингидрина, образуя окрашенный продукт сине-фиолетового цвета.

К 5-7 каплям раствора аминокислоты или гидролизата белка прибавляют 2-3 капли 0,1%-ного раствора нингидрина в ацетоне, кипятят 2 минуты. Появляется сине-фиолетовое или розово-фиолетовое окрашивание.

Опыт 5. Осаждение белков кипячением

Если нагреть раствор белка до кипения, происходит выпадение белка в осадок (денатурация). Более полное осаждение белка достигается слабым подкислением его уксусной кислотой или добавлением каких-либо электролитов. Явление денатурации связано с потерей белками нативных свойств, растворимости и вызывается глубокими нарушениями его структуры.

1-2 мл раствора белка нагревают в пробирке до кипения и наблюдают выпадение осадка белка.

Опыт 6. Осаждение белков солями тяжелых металлов

Белки с ионами тяжелых металлов образуют соли, нерастворимые в воде.

а) К 2-3 мл раствора белка приливают по каплям 5%-ный раствор CuSO₄. Появляется осадок, растворяющийся в избытке реактива.

б) К 2-3 мл раствора белка добавляют по каплям 5%-ный раствор ацетата свинца (CH₃COO)₂Pb. Появляется осадок, растворяющийся в избытке реактива.

Опыт 7. Осаждение белков концентрированными кислотами

Концентрированные кислоты вызывают денатурацию белка и его осаждение.

К 2-3 мл крепкой азотной кислоты осторожно по стенкам (в наклонном положении пробирки) приливают пипеткой 1-2 мл раствора белка. На границе двух соприкасающихся жидкостей образуется белое кольцо свернувшегося белка.