Вопрос 25. Характеристика методов дифференциального окрашивания хромосом.

Разработан ряд методов окрашивания (бэндинга), позволяющих выявить комплекс поперечных меток (полос, бэндов) на хромосоме. Каждая хромосома характеризуется специфическим комплексом полос. Гомологичные хромосомы окрашиваются идентично, за исключением полиморфных районов, где локализуются разные аллельные варианты генов. Аллельный полиморфизм характерен для многих генов и встречается в большинстве популяций. Выявление полиморфизмов на цитогенетическом уровне не имеет диагностического значения.

Q-окрашивание. Первый метод дифференциального окрашивания хромосом был разработан шведским цитологом Касперссоном, использовавшим с этой целью флюоресцентный краситель акрихин-иприт. Под люминесцентным микроскопом на хромосомах видны участки с неодинаковой интенсивностью флюоресценции - Q-сегменты. Метод лучше всего подходит для исследования Y-хромосом и потому используется для быстрого определения генетического пола, выявления транслокаций (обменов участками) между Х- и Y- хромосомами или между Y-хромосомой и аутосомами, а также для просмотра большого числа клеток, когда необходимо выяснить, имеется ли у больного с мозаицизмом по половым хромосомам клон клеток, несущих Y-хромосому.

G-окрашивание. После интенсивной предварительной обработки, часто с применением трипсина, хромосомы окрашивают красителем Гимзы. Под световым микроскопом на хромосомах видны светлые и темные полосы - G-сегменты. Хотя расположение Q-сегментов соответствует расположению G-сегментов, G-окрашивание оказалось более чувствительным и заняло место Q-окрашивания в качестве стандартного метода цитогенетического анализа. G-окрашивание дает наилучшие результаты при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы).

R-окрашивание дает картину, противоположную G-окрашиванию. Обычно используют краситель Гимзы или флюоресцентный краситель акридиновый оранжевый. Этим методом выявляют различия в окрашивании гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.

С-окрашивание используют для анализа центромерных районов хромосом (эти районы содержат конститутивный гетерохроматин) и вариабельной, ярко флюоресцирующей дистальной части Y-хромосомы.

Т-окрашивание применяют для анализа теломерных районов хромосом. Эту методику, а также окрашивание районов ядрышковых организаторов азотнокислым серебром (AgNOR-окрашивание) используют для уточнения результатов, полученных путем стандартного окрашивания хромосом.

Вопрос 26. Тест полового хроматина и его применение.

Хроматин половой - (sex chromatin) - хроматин, присутствующий только в женских соматических клетках и представляющий одну инактивированную Х-хромосому, которая остается в конденсированной форме. В соматических клетках женщины содержится по одной активной Х-хромосоме. По половому хроматину можно определить пол ребенка до его рождения; такое определение производится путем изучения клеток, полученных в ходе амниоцентеза, или в процессе исследования хорионических ворсинок. Существует два основных вида хроматина: 1) тельце Барра (Вагг body) - небольшое образование по краям ядра внутри ядерной оболочки, которое окрашивается при воздействии на него основных красителей; и 2) напоминающий барабанные палочки придаток ядра в нейтрофилах (разновидности белых клеток крови).

Изучение полового хроматина является важным клиническим тестом в клинике различных заболеваний, а простота исполнения находит очень широкое применение. В 1955 г Моор и Барр описали метод определения полового хроматина в соскобах слизистой оболочки ротовой полости (буккальный тест). Для получения материала соскабливание с внутренней поверхности щеки необходимо делать утром натощак. Клетки поверхностного слоя содержат множество микроорганизмов и имеют пикнотические ядра, что делает их негодными, для исследования. Поэтому сначала шпателем снимают поверхностный слой эпителия, непригодный для исследования, а затем другим краем шпателя получают клетки из среднего слоя слизистой оболочки и аккуратно размазывают материал на стекле. У лиц женского пола половой хроматин в соскобах слизистой оболочки рта встречается приблизительно 20-30 % клеток. У лиц мужского пола в этих соскобах находят лишь до 5 % клеток с половым хроматином. Половой хроматин окрашивается всеми основными ядерными красителями. В 1968 г. группа шведских цитологов во главе с Т. Caspersson сообщила о новом люминесцентном микроскопическом методе исследования хромосом, применение которого показало, что в флюорохромированных акрихин -ипритом хромосомах человека наблюдается очень яркое свечение дистальных отделов длинных плеч У-хромосомы. С помощью различных тестов полового хроматина можно дифференцировать комплекс неполно феминизации и комплекс внешнего неполного мужского гермафродитизма. Вид внешних половых органов в обоих этих случаях может быть почти идентичным. Тест полового хроматина оказывает большую помощь в распознавании таких редких комплексов, как комплекс липидной дегенерации надпочечников и семенников, маскулинизирующих бугорков яичника и других. Изучение полового хроматина нашло целый ряд других применений. В судебной медицине применяется тест полового хроматина пола особи, располагая лишь кусочком его ткани. О степени злокачественности опухоли может служить тест полового хроматина с кусочком ткани опухоли, взятому у женщины (критерий – низкое число клеток, содержащих тельца Барра). Таким образом, изучение полового хроматина и "барабанных палочек" сигнализирует о возможных нарушениях полового развития.