101. Инструменты генетической инженерии

Инструментами генетической инженерии являются ферменты и векторы.

Ферменты:

• Рестриктазы

• Обратная транскриптаза (может образовывать копии ДНК)

• Лигазы (сшивают ДНК)

• Ферменты изменяющие структуру концов ДНК

• ДНК-полимеразы (достраивают ДНК)

• Щелочные фосфотазы (не дают смыкаться концам ДНК)

• Ферменты для получения радиоактивных зондов.

102. Принципы создания рекомбинантных молекул in vivo.

Этапы: 1) необходим вектор, обладающий определенными свойствами: быть репликоном(иметь точку О) 2)должен быть механизм для фрагментации геномов (за сет рекомбинации систем) 3)гены должны экспресироваться. Генная иженерия in vivo ограничена прокариотами.

103. Поняте о репликоне. Основные типы репликонов

Репликон- структура, способная самостоятельно реплицироваться (хромосомы и плазмиды бактерий). Каждый репликон в процессе клеточного деления активируется 1 раз, независимо от того, содержит клетка только одну хромосому (как у прокариот) или несколько ( эукариоты).

Репликон должен обладать структурными элементами:

а) точка начала репликации (origin), в которой инициируется пр-с удвоения ДНК

б) точка окончания репликации (terminus), в которой пр-с удвоения ДНК останавливается.

Репликация контролируется на стадии инициации, т.к. начавшись этот процесс продолжается до тех пор, пока весь репликон не удвоится.зн, скорость репликации генома регулирется частотой инициирующих событий.

Частота, с которой происходит инициирование репликации, контролируется регуляторным белком или белками, способными взаимодействовать с точкой начала репликации.

- репликон прокариот – любая молекула ДНК, которая содержит точку начала репликации, способна самостоятельно реплицироваться в клетке.

- репликон эукариот- единица репликации, содержащая только 1 точку начала начала репликации, при этом любой необходимый белок м.быть продуктом другой контролирующей единицы. Бактериальная хромосома содержит 1 репликон и 1 точку начала репликации, поэтому инициация репликации в этой единственной точке приводит к репликации всего генома.

Эукариотическая хромосома содержит большое число репликонов. За 1 клеточный цикл все репликоны должны быть активированы, но эта активация начинается не одновременно. Каждый из репликонов должен быть активирован1 раз. В клетке должен сущесьвовать определенный сигнал, позволяющий отличать реплицированные репликоны от нереплицированных и показывающий завершение всего процесса.

104)Рестрицирующие эндонуклеазы,их основные характеристики область применения

Становление генной инженерии связано с открытием и использованием специального класса ферментов-специфических эндонуклеаз,или рестриктаз.Ферменты этого типа являются составной частью системы рестрикции-модификации прокариотических клеток.Различают 3 основных класса рестриктаз :1,2,3.Все рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго определённые нуклеотидные последовательности.Однако рестриктазы 1 осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК,а рестриктазы классов 2,3-узнают и расщепляют ДНК в строго определённых точкахвнутри сайтов узнавания.В генной инженерии используют рестриктазу 2(т.к. ферменты эти состоят из 2 отдельных белков-рестрицирующей эндонуклеазы,модифицирующей метилазы).

Испльзуют при конструировании рекомбинантных молекул.

Палиндромные последовательности, которые распознаются рестриктазами и в которых происходит расщепление называются сайтами узнавания. Разрывы в цепи ДНК могут располагаться наискось друг от друга, в р-те чего образуются одноцепочечные липкие концы.

105.Способы «нарезания» фрагментов ДНК. Несколько способов «нарезания» в основанном с участием рестриктаз. Одна из первых рестрицирующих эндонуклеаз типа II была выделена из бактерии Escherichia coli и получила назваие EcoRI. Этот фермент узнает участок ДНК, содержащий специфическую палиндромную последовательность (последовательность-перевертыш, идентичную в обеих цепях при прочтении в направлении 5'-->3') из шести пар оснований и вносит разрыв между остатками гуанина и аденина в каждой цепи, расщепляя связь между атомом кислорода при 3'-атоме углерода сахарного остатка одного нуклеотида и фосфатной группой, присоединенной к 5 '-углеродному атому сахарного остатка соседнего нуклеотида. Разрывы в цепи ДНК располагаются наискось друг от друга, в результате чего образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из четырех нуклеотидов в каждом (липкие концы). Каждый одноцепочечный «хвост» заканчивается 5'-фосфатной группой, а 3'-гидроксильная группа противоположной цепи как бы утоплена. Помимо EcoRI, из бактериальных клеток были получены сотни рестрицирующих эндуклеаз типа II. Палиндромные последовательности, которые распознаются рестрицирующими эндонуклеазами типа II и в которых происходит расщепление молекулы ДНК, называются сайтами узнавания. Помимо рестриктаз, гидролизующих (расщепляющих) полинуклеотидную цепь с образованием липких концов, существуют рестриктазы, которые вносят разрывы в цепи строго друг против друга с образованием фрагментов ДНК с «тупыми» концами (рис. 4.3). Сайты узнавания могут состоять из четырех, пяти, шести, восьми или более пар нуклеотидов (табл. 4.1). От длины сайта узнавания зависит частота его распространения в молекуле ДНК; в большинстве случаев используют рестриктазы, узнающие тетра- и гексануклеотиды. Рестрицирующие эндонуклеазы типа II играют ключевую роль при генном клонировании. Обработка образца ДНК определенной рестриктазой всегда дает один и тот же набор фрагментов — при условии, что расщепление происходит по всем сайтам узнавания. Если использовать несколько ферментов рестрикции и сначала обработать ДНК каждой из рестриктаз в отдельности, а затем их комбинациями, можно построить физическую карту данной ДНК, т. е. установить порядок следования сайтов рестрикции вдоль молекулы. Определив размер полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза, можно найти положение рестрикционных сайтов.