98. Генетическая инженерия и технология рекомбинантных молекул

Современная стратегия генетической инженерии, суть которой заключается в сле­дующем:

1) в небольшую молекулу ДНК, способную реплицироваться в клетке автономно от хромо­сомы (плазмиду или вирусную ДНК), ферментативно встраивают фрагменты молекул ДНК любого изучаемого организма или искусствен­но синтезированные сегменты ДНК;

2) образующиеся при этом молекулы (гиб­ридные ДНК), вводят, в чувствительные прокариотические или эукариотические клетки, где они реплицируются, размножая в своем составе встроенные фрагменты ДНК;

3) определенными методами отбирают кло­ны клеток или вирусов, содержащих индивиду­альные типы молекул гибридных ДНК;

4) выявленные гибридные ДНК подвергают разностороннему структурно-функционально­му изучению, особую роль при этом играют вы­сокоэффективные методы расшифровки после­довательности нуклеотидов (секвенирования) фрагментов ДНК.

Молекулы ДНК, создаваемые методами ге­нетической инженерии, часто называют рекомбинантными ДНК (рекДНК). Иногда такие молекулы ДНК называют гибридными ДНК, чтобы под­черкнуть их отличие от молекул, образуемых ин виво в результате естественной рекомбинации природных ДНК по областям гомологии.

99.Основные окрытия, теоретически обосновавшие технологический подход к наследственной информации.

1944г. – Эвери показал роль ДНК как носителя генетической информации.

1953 – Котсон и Крик показали структуру ДНК

Эксперементальное подтвержение уникальности генетического кода

Интенсивное развитие молекулярной генетики Е. коли

Отработка методов выделения плазмид и вирусов

Разработка методов введения плазмид и вирусов обеспечивающих репликацию ДНК и экспрессию генов

Открытие ряда ферментов использующих в качестве субстрата и катализирующих ими реакции

100. Общие понятия о матричных процессах: репликация, транскрипция, трансляция.

РЕПЛИКАЦИЯ (от позднелат. replicatio - повторение) (редупликация), самовоспроизведение нуклеиновых к-т (обычно ДНК, у нек-рых вирусов РНК), обеспечивающее точное копирование генетич. информации и передачу ее от поколения к поколению. При репликации ДНК нуклеотидная последовательность копируется (целиком или частично) в виде комплементарной последовательности дезоксирибонуклеотидов.

Теоретически возможны три механизма репликации:

1. Консервативный механизм, при котором сохраняется целостность всей родительской двойной спирали (не происходит раскручивания спирали), и она является матрицей для синтеза себе подобной. Дочерняя двойная спираль полностью образуется из нового материала, а родительская как таковая сохраняется.

2. Дисперсивный механизм, в соответствии с которым родительская молекула ДНК распадается на фрагменты, а синтез новых цепей происходит на фрагментах, которые затем крест-накрест объединяются с отрезками нового материала. Каждая полинуклеотидная цепь в этом случае должна была бы состоять из чередующихся отрезков старого и нового материала.

3. Полуконсервативный механизм предполагает, что родительская двойная спираль раскручивается, и каждая полинуклеотидная цепь служит матрицей для синтеза новой комплементарной цепи. Таким образом, новая двойная молекула оказывается «гибридом» старой и вновь синтезированной цепи.

ТРАНСКРИПЦИЯ (от лат. transcriptio, букв-переписывание), биосинтез РНК на матрице ДНК; первая стадия реализации генетич. информации, в ходе к-рой нуклеотидная последовательность ДНК считывается в виде нуклеотидной последовательности РНК. В основе этого процесса лежит принцип комплементарного спаривания пуриновых и пиримидиновых оснований. Транскрипция осуществляется с участием фермента РНК-полимеразы, использующей в качестве субстратов рибонуклеозидтрифосфаты. Кроме того, в транскрипции участвует большое число вспомогат. белков, регулирующих работу РНК-полимеразы.

Процесс синтеза РНК можно разделить на четыре основные стадии: 1) связывание РНК-полимеразы с промотором, 2) начало синтеза цепи РНК (инициация), 3) рост цепи РНК (элонгация), 4) завершение синтеза цепи РНК (терминация).

Связывание РНК-полимеразы с промотором включает по крайней мере два этапа. На первом РНК-полимераза образует с промотором закрытый комплекс, в к-ром ДНК сохраняет двухспиральную структуру, а РНК-полимераза еще не способна начать синтез РНК. На втором закрытый комплекс превращается в открытый, в к-ром РНК-полимераза расплетает примерно один виток двойной спирали ДНК в районе стартовой точки-нуклеотида, с к-рого начинается комплементарное копирование матрицы.

При наличии субстратов РНК-полимераза в открытом комплексе осуществляет инициацию. На стадии инициации образующаяся РНК связана с матрицей и ферментом непрочно и может отделиться от комплекса. Стадия инициации завершается, когда цепь РНК достигает критич. длины (от 3 до 9 нуклеотидов на разных промоторах); при этом от РНК-полимеразы отделяется s-субъединица.Считают, что в процессе элонгации примерно 13 нуклеотидов РНК образуют гибридную спираль с матричной нитью расплетенной ДНК (всего на этой стадии в ДНК расплетено примерно 18 нуклеотидов). По мере движения РНК-полимеразы по матрице впереди нее происходит расплетание, а позади восстановление двойной спирали ДНК. Одновременно происходит вытеснение очередного звена растущей цепи РНК из комплекса с матрицей.

Терминация транскрипции, как правило, происходит в строго определенных участках матрицы - терминаторах, в к-рых от матрицы отделяются РНК и РНК-полимераза; последняя, объединившись со свободной s-субъединицей, может вступить в следующий цикл транскрипции.

ТРАНСЛЯЦИЯ (от лат. translatio-передача), программируемый генами процесс синтеза белка. Посредством трансляции осуществляется реализация генетич. информации нуклеиновых к-т.Трансляция каждой молекулы мРНК рибосомой разделяется на три четкие последоват. стадии-инициацию, элонгацию полипептида (собственно трансляция) и терминацию. Цепь мРНК транслируется (считывается) по направлению от 5'-конца к 3'-концу. Полипептид элонгируется (растет) от N-конца к С-концу.