2. Материал и методика исследований

Основной моделью для исследований послужила приобская популяция алтайского зеркального карпа (АЗК) в процессе породообразования, дополнительной чумышская. Основная часть работ выполнена в племенных хозяйствах-оригинаторах Алтайского края – АОЗТ «Зеркальное» и ГУП «Племенном рыбоводном хозяйстве "Рыбное"». Исследования проводили по схеме отраженной на рис.3.

Регион создания породы алтайский зеркальный карп – юг Западной Сибири. Для региона характерны резкая континентальность климата, значительное разнообразие природных условий и связанные с ними различия продуктивных качеств в пригодных для рыбоводства водоемах. Созданная в этих условиях порода представлена двумя репродуктивно изолированными стадами в I и II зонах рыбоводства.

Рыбу выращивали при повышенных и малых плотностях посадки с применением комбикормов и удобрений по биотехнике, разработанной для алтайского зеркального карпа в процессе селекционно-племенной работы (Иванова, 1985; Морузи, 1995). Плотности посадки при выращивании сеголетков в прудах составляли от 10 до 50 тыс/га, двухлетков – 0,5 - 6,0 тыс/га, производителей и старшего ремонтного молодняка – 200 экз/га. При малой плотности посадки рыб кормление не применяли. Скорость прироста массы тела укладывалась в нормативы для племенных рыб (Иванова, Морузи, Пищенко, 2003) (табл. 1, 2, 3 и 4).

Рис. 3. Схема исследований

Племенные особи имеют зеркальный чешуйчатый покров разбросанного типа, отличаются повышенной скоростью роста, эффективным использованием кормов на прирост массы, обладают высокими репродуктивными качествами, жизнестойкостью на стадиях сеголеток-годовик.

В I рыбоводной зоне с коротким вегетационным периодом создается чумышский внутрипородный тип алтайского зеркального карпа для пастбищного содержания и невысокоинтенсивных технологий. Во II зоне - приобский внутрипородный тип для интенсивных и интегрированных технологий рыбоводства.

Контролируемыми признаками служат указанные породные свойства. Их параметры определены целевыми стандартами создаваемых экологических типов породы. Племенные стада оцениваются по величине разнообразия селекционных и рыбоводно-биологических признаков, экстерьеру, интерьеру и характеру наследования признаков. Эффект по стабилизации и совершенствованию признаков достигается массовым направленным улучшающим отбором.

Отбор по комплексу признаков и подбор групп по принципу «лучшие к лучшим», выполняли так же, как и при создании породы. Скрещивания с другими породами и популяциями карпа не проводили. Предполагаемое присутствие в популяции гомозигот по некоторым полиморфным белковым системам вызвало необходимость строгого планирования и повышения интенсивности селекции, особенно на ранних этапах развития организма рыб.

С целью предотвращения вероятности проявления инбридинга при возможном переходе рецессивных аллелей в гомозиготное состояние была применена повышенная системность отбора. Значимость такого отбора выявлена при селекции рыб и других животных (Schaperclaus, 1961; Эйснер, 1981; Головинская, Боброва,1982). Признаки для отбора ремонтного поголовья и производителей выбирали с учетом положительной корреляции их с желательными свойствами создаваемых внутрипородных типов и с достигнутыми величинами у породы.

Отбор ремонтного молодняка начинали с определения средней массы и ее вариабельности у рыб в данном возрасте. По их величинам определяли интенсивность отбора, селекционный дифференциал и ориентировочную массу тела рыбы после отбора.

Известно, что в генной системе на ранних этапах развития относительно сильным является эффект генов общего роста, определяющий также размеры и пропорции тела рыб. С возрастом большее значение приобретают системы генов контролирующие репродуктивные признаки (Тищенко, 1985). Поэтому коэффициент напряженности отбора по массе был наиболее высоким у младших возрастных групп.

При отборе годовиков использовали коэффициент роста, применяемый рыбоводами Польши (Wlodek, 1972). Отношение массы тела после и до отбора более 1.

Весной отбор вели из стад рыб высокой численности с известным происхождением (как правило, это население 1-3 зимовальных прудов численностью 300-500 тыс. экз. в каждом). Осенью отбирали потомство рыб классов элита и первый с наиболее высоким темпом роста.

Возрастная раннеспелость гонад у приобского стада достигается отбором и подбором рыб для воспроизводства. В селекционное стадо включали самок четырехгодовиков и самцов трехгодовиков с наиболее выраженными признаками половой зрелости. Их оценивали по плодовитости и качеству потомства, особенно на ранних стадиях онтогенеза, с повторной оценкой тех же рыб в последующие возрастные периоды.

При создании экологических типов интенсивность отбора ниже, чем при создании породы. Рыб в возрасте 1-3 года отбирают только по массе с одновременным контролем показателей экстерьера, имеющим прямую положительную связь с селекционными признаками породы и типа.

У приобского типа селекционируемые признаки при отборе выше стандартов для племенных рыб, предусмотренных инструкцией по бонитировке и нормативами (Инструкция по бонитировке карпа, 1988; Справочник нормативно-технологической документации по товарному рыбоводству, 1986). Выше и интенсивность отбора. Годовиков оставляют в племенном стаде от 1 до 10%, четырехгодовиков – 45-50% (табл.1).

Показатели отбора ремонтного молодняка при создании приобского типа алтайского зеркального карпа

Показатель	Возраст
	годовики	двухгодовики	трехгодовики	четырехгодовики
Коэффициент отбора, %	1-10	20-30	35-40	45-50
Селекционный дифференциал по массе тела (среднее в разные годы), г	50-70	300-500	300-700	400-800
Масса тела рыб в данном возрасте после отбора, г	120-160	1200-1700	2500-3000	3000-4000
Индексы телосложения
обхвата тела		93-100	88-97	88-97
широкоспинности		20-22	20-24	21-25

По чумышскому типу значения признаков для отбора выбраны в пределах стандартных величин (табл. 2).

Показатели отбора ремонтного молодняка при создании

чумышского типа

Показатель	Возраст
	двухгодовики	трехгодовики	четырехгодовики
Коэффициент отбора, %	20-30	35-40	45-50
Селекционный дифференциал по массе тела (среднее в разные годы), г	200-300	200-400	300-600
Масса тела рыб в данном возрасте после отбора, г	600-900	1600-2200	2500-3000
Индексы телосложения
обхвата тела	80-90	78-92	78-92
широкоспинности	16-20	16-22	17-22

Отбор в этом стаде начинают с двухгодовиков с напряженностью 20-30%. У старшего ремонтного молодняка интенсивность отбора снижается до 45-50%.

В процессе исследований минимальная численность половозрелых рыб была достаточной для «разведения в себе». При заводском и естественном воспроизводстве она составляла не менее 300 полных гнезд. Предусмотрена ежегодная замена 25% производителей.

На каждого племенного производителя при заводском воспроизводстве, замененного в процессе селекции, в племенном стаде оставляют 2700 годовиков, 14 двухгодовиков, 4 трехгодовиков, 2 четырехгодовиков. При размножении в нерестовых прудах численность ремонтного поголовья возрастает за счет изменения соотношения самок и самцов в стаде рыб.

Принятая напряженность отбора позволяет устранить нежелательные генотипы уже в раннем возрасте и сохранить в стадах рыб с признаками и свойствами, отвечающими задачам селекции.

В настоящее время в племенное стадо производителей половозрелые самки приобской популяции переводятся в возрасте 4 года, чумышской – в 5 полных лет, а самцы – на 1 год раньше.

В племенных стадах заменяли рыб, не соответствующих стандарту породы по темпу роста, возрасту, травмам, пригодности к заводскому воспроизводству и другим признакам. Племенные стада производителей ежегодно пополняли особями классов элита и первый. В племенные стада переводили в два этапа. На первом проводили классную оценку самок и самцов по разработанным шкалам, включающим возраст рыб, массу тела в данном возрасте, морфологические признаки (индексы широкоспинности, сбитости, прогонистости) и определяли соответствие желательному типу.

При разработке шкал классной оценки учитывали существующие отличия самок и самцов в приобском и чумышском стадах. У самок приобской популяции в отличие от чумышской минимальная масса тела в данном возрасте выше на 500-1000 г.

В обоих стадах не включаются в племенную группу самки и самцы с общей суммой произведений количества баллов на число значимости признака, равное 60.

На первом этапе классификации проводили индивидуальное мечение рыб красителями по общепринятым методикам.

На втором этапе самок оценивали по плодовитости по 3-балльной шкале. Из стада выводили самок, имеющих рабочую плодовитость менее 100 г икры на 1 кг массы тела при заводском воспроизводстве и менее 50 тыс. личинок от самки при естественном размножении.

Самцов оценивали по шкалам классной оценки, разработанным также для каждого стада по достигнутым показателям.

При эксплуатации племенных рыб кроме признаков, включенных в шкалы оценки, контролировали показатели продуктивности - скорость роста и затраты корма на прирост массы, жизнестойкость. С этой целью проводили научно-хозяйственные опыты и обобщали производственные данные.

Особей для размножения подбирали с учетом их классной принадлежности, возраста, пола и зрелости гонад по известным методикам (Правдин,1966; Мартышев, 1973; Иванова и др., 1989). При подборе групп для размножения класс самок мог быть выше, чем у самцов.

При воспроизводстве учитывали репродуктивные признаки (количество, качество икры и молок, выход разновозрастных личинок, мальков) по общепринятым методикам.

Морфологический анализ рыб выполняли по руководству И.Ф. Правдина (1966) с использованием схемы измерений карповых рыб Л.С. Берга (1948). При отборе были выбраны промеры, связанные с направлением селекции – масса рыбы в данном возрасте, длина тела, длина тушки, наибольшие высота, обхват и толщина тела. Изучены некоторые интерьерные признаки: относительная масса гонад, сердца, печени, селезенки, интенсивность дыхания. Вскрывали рыб и взвешивали внутренние органы по методике В.В. Смирнова и др.(1972). Остеологический анализ осуществляли по методике В.Н.Яковлева и др.(1981).

Морфологический анализ проводили в мае-июне, во время весенней бонитировки племенных стад. Для изучения скорости роста применяли общепринятые методики (Шмальгаузен,1938; Шпет, 1971).

Сравнение рыб разных поколений селекции выполнено по указанным признакам. Для сравнения седьмого поколения с более ранними использовались первичные данные полученные сотрудниками СибНИИПТИЖ в 1975-1990 гг. любезно предоставленные авторами породы. Данные обработаны с использованием современной вычислительной техники.

Абсолютную и относительную плодовитость определяли по общепринятым методикам, ежегодно во время нереста (Иоганзен, 1955а, 1955б; Правдин,1966; Анохина,1969 и др.).

Исследования по раннеспелости проводили на рыбах младших возрастных групп (сеголетках, двухлетках и трехлетках) в ОАО «Племрыбхоз «Зеркальный» (ОАО «Маяк») весной и осенью при бонитировке стада.

Оценка качества спермы самцов проводилась в возрасте от 3 до 5 лет. Сперму брали во время заводского воспроизводства. Самцам ставили разрешающую инъекцию гипофиза из расчета 1,2 мг на самца. Отбирали сперму в специальный градуированный бюкс для учета количества эякулята. Путем глазомерной оценки под микроскопом на предметном стекле определяли концентрацию сперматозоидов в семенной жидкости. Подсчет сперматозоидов в сперме, разбавленной 5%-м раствором NaCI, проводили в камере Горяева по общепринятой в рыбоводстве методике (Казаков, 1978). Соотношение живых и мертвых сперматозоидов устанавливали по методике, усовершенствованной В.Н. Жукинским (1964). На обезжиренное предметное стекло наносили каплю семенной жидкости, затем туда добавляли 2-3 капли 5%-го водного эозина. Далее эту суспензию в течение 2 секунд перемешивали специальной стеклянной палочкой и при помощи шлифованного покровного стекла наносили на предметное стекло.

После того как мазки высыхали, их просматривали под микроскопом. Сперматозоиды, которые в момент окраски находились в живом состоянии, не окрашивались, а мертвые были окрашены в красный цвет. Далее осуществляли подсчет сперматозоидов, отмечая при этом количество окрашенных, и после этого вычисляли процент мертвых и живых. Объем наблюдений представлен в таблице 3.

Общая характеристика исследований

Виды исследований	Повторность	Общее количество материала (проб, рыб, анализов)
Экстерьерные признаки:
общая масса рыбы, Q	2 раза в год: май и сентябрь	3000
абсолютная длина рыбы, L		3000
длина тела, l		3000
наибольшая высота тела, Н		3000
наибольшая толщина тела рыбы, B		3000
наибольший обхват тела рыбы, U см		3000
абсолютная рабочая плодовитость, г икры или количество икринок от 1 самки при заводском воспроизводстве, АРП	Ежегодно в мае-июне	150-250
относительная рабочая плодовитость, г икры или шт. икринок на 1 кг массы самки, ОРП		130
Интерьерные признаки:	Ежегодно в сентябре и мае
гематологические показатели		150
полиморфные белки крови и мышц (трансферрины, альбумины, преальбумины, эстеразы, миогены)		60
остеологические показатели	Ежегодно в октябре, январе, апреле	400
гематологические показатели для определения особенностей зимовки		270

Биохимический анализ проведен по руководству П. Т. Лебедева, А. Т. Усовича (1976).

В нашей работе принято считать интактными – самцов без гипофизарной инъекции.

Показатели крови определяли у здоровых особей в возрастном интервале от сеголетков до пятилетков. Наряду с показателями крови исследовали характер возрастных изменений индексов кроветворных органов.

Исследования крови для определения гематологического статуса породы и поколений проводили по известным методикам (Пучков, 1954; Alexander, Ingram, 1980; Мусселиус, 1983 и др.) в октябре, при температуре воды в прудах 6…10С .

Для анализа брали чистую кровь, полученную прямым уколом в сердце или хвостовую артерию. Общее количество красных и белых кровяных телец определяли в камере Горяева. Лейкограммы выводили по общепринятой методике в окрашенных по Гимза-Романовскому мазках крови.

Анализ полиморфных белковых локусов делали методом вертикального диск-электрофореза в полиакриламидном геле по прописям Р.Мауера (1971) с некоторыми модификациями. Электрофорез проводили в блоках 7,5%-го полиакриламидного геля, в камере К.А. Трувеллера, Г.Н. Нефедова (1974). Растворы и буферные смеси готовили по прописям Б.Дэвиса (Davis,1984). Окраску на трансферрины и миогены проводили в 0,25%-м растворе амидочерного 10Б или кумасси блау в 10%-й трихлороуксусной или 7%-й уксусной кислоте. Эстеразы окрашивали прочным красным TR в присутствии альфанафтилацетата. Гели отмывали и хранили в 7%-й уксусной кислоте. При выявлении и идентификации белковых локусов буквенные названия присваивали в соответствии с системой обозначения трансферринов Н.Б. Черфас, К.А. Трувеллера (1978) и системой эстераз Н.В. Щегловой, Ю.И. Илясова (1979).

Для расшифровки фореграмм дополнительно использовали пробы крови и мышц сеголетков казахского карпа и среднерусского карпа отводки З-НК (Дёмкина, 1993), которые вводили в качестве контрольных в первую и последнюю лунки геля. Частоту генотипов рассчитывали по уравнению Харди-Вайнберга, ошибки частот генов – по формуле, приведенной в книге В.Н. Тихонова (1967). Степень соответствия ожидаемых (теоретических) генотипов наблюдаемым (фактическим) определяли по критерию ² (Рокицкий,1973):

,

где f – эмпирические частоты; f ' – теоретические.

Индекс генетического сходства рассчитывали по формуле M. Нeя (Кирпичников, 1987; Катасонов, Гомельский,1991):

где, x_i, y_i – частоты аллеля данного гена в двух сравниваемых группах рыб.

По результатам проведенных опытов и измерений создана компьютерная база данных.

Статистическую обработку материала проводили с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel. Вычисляли среднее значение ( ), ошибку средней величины ( ), стандартное отклонение (), коэффициент фенотипической вариации (Cv). Разницу средних величин оценивали по критерию Стьюдента и вероятности Р, которую признавали статистически значимой при P0,95.

Соответствие полученных данных Гауссовому распределению оценено с использованием визуальной проверки с помощью гистограммы с наложением кривой нормального распределения и критерия согласия Колмагорова-Смирнова, результаты которого показали, что отклонение от нормального распределения не существенно – Р во всех случаях значительно больше 0,95, то есть вероятность ошибки не является значимой; поэтому значения переменных полученных в результате исследования достаточно хорошо подчиняются нормальному распределению.