Теоретичні питання:

1.Біологічні властивості збудника дифтерії. Мікробіологічна діагностика дифтерії. Специфічна профілактика і терапія.

2.Біологічні властивості збудників кашлюку та паракашлюку. Мікробіологічна діагностика і специфічна профілактика.

При підготовці до заняття користуйтеся літературою:

1. К.Д.П'яткін, Ю.С. Кривошеїн. Мікробіологія. - К.: Вища школа, 1992.- С.240-243, 286-292.

3. К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеин. Микробиология. - М.: Медицина, 1981.- С.301-305,334-341.

4. В.Д. Тимаков, В.С.Левашов, Л.Б.Борисов. Микробиология.- М.: Медицина, 1983.- С.314-316, 340-344.

5. Л.Б.Борисов, А.М. Смирнова. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология.- М.: Медицина, 1994.- С.297-299, 307-311.

6. К.Д.Пяткин, Н.С.Маркова, Н.Д.Трохимова. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии.- М.: Медицина, 1969.- С.228-230, 237-242. .

7. Руководство к лабораторним заняттям по микробиологии. Под редакцией Л.Б.Борисова. – М.: Медицина, 1984.- С.160-163, 171-174.

8. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. Л.Б.Борисов и др..- М.: Медицина, 1993.- С.173-180.

9. Поздеева О.К. Медицинская микробиология Под ред. акад. Покровского В.И., М.: ГЕОТАР, 1998.- с.230-243, 329-336.

10. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. СПб, СпецЛит, 1998.- с.406-414

11. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. Под ред. Воробьева А.А. М.: МИА, 2004. - с.440-450, 387-391

12. Лекція для студентів.

13.Пояснення до самостійної роботи (додаток 1)

14. Графи логічної структури (додаток 2,3)

ПРАКТИЧНА РОБОТА СТУДЕНТІВ

1. Фіксований препарат C.diphtheriae зафарбувати за Грамом, мікроскопувати, зарисувати.

2. Вивчити демонстраційні препарати та культури. Зарисуйте та запишіть в протокол

Алгоритм практичної роботи

Робота 1. Фіксований препарат зафарбувати за Грамом. При мікроскопії звернути увагу на особливості фарбування (тинкторіальні властивості) збудника: підвищена інтенсивність фарбування потовщень на полюсах (включення зерен волютину) і менш зафарбована центральна частина паличковидних бактерій. Характерно, як поодиноке розміщення бактерій, так і попарне (в вигляді римської цифри V). Можна зустріти також скупчення, що нагадують розставлені пальці, розсипані шпильки.

Відобразьте особливості фарбування і взаємного розміщення бактерій на рисунку.

ДЕМОНСТРАЦІЯ

МІКРОСКОПІЧНІ ПРЕПАРАТИ

1.C.diphtheriae, фарбування за Грамом, Лефлером, Нейссером

Збудник має вигляд палички з потовщеннями на кожному кінці. Бактерії розміщуються поодиноко або невеликими скупченнями, в котрих одні кінці паличок зближені, а інші віддалені одна від одної (порівнюють з розсипаними шпильками, розставленими пальцями і т.д.).При фарбуванні за Грамом бактерії фарбуються в фіолетовий колір, за Лефлером – в синій. В обох випадках зерна волютину, розміщені на полюсах, фарбуються більш інтенсивно, ніж інша частина клітини (явище метахромазії). При фарбуванні за Нейссером характерно фарбування центральної частини клітини в жовтий колір з синьо-чорними зернами волютину. Представля певну важкість диференціація за морфологічними і тинкторіальними властивостями збудників дифтерії від дифтероїдів та удаванодифтерійних бактерій (непатогенних мешканців слизової оболонки верхніх дихальних шляхів). Для останніх характерна відсутність зерен волютину та паралельне розміщення відносно одне одного в скупченнях.

2.B.pertussis, фарбування за Грамом. Дрібні грамнегативні коккобактерії.

ПОЖИВНІ СЕРЕДОВИЩА

3.Кров’яний телуритовий агар

До 100 мл розплавленого і охолодженого до 45-50°С поживного агара добавляють 10 мл дефібринованої або гемолізованої кінської або бичої крові і 2 мл 2% розчину телуриту калію (К2ТеО3). Перед використанням чашки підсушують 15-20 хвилин в термостаті.На цьому середовищі колонії дифтерійних бактерій мають чорний колір або чорний центр (відновлення металічного теллура). Колонії дифтероїдів більш випуклі, вологі, сірого кольору з коричневим центром. Колонії удавано дифтерійних паличок непрозорі, дрібні, сірі з коричневим центром.

4.Середовище Клауберга ІІ (елективне)

100 мл 3% поживного агару розплавляють, добавляють 3 мл 2% розчину телуриту калію (затримує розвиток супутньої флори), 10 мл гліцеринової суміші і 50 мл лакової крові. Середовище розливають в чашки Петрі. Лакова кров: до 35мл стерильної дистильованої води добавляють 15мл дефібринованої крові будь якої тварини. Гліцеринова суміш: до 40 мл дефібринованої крові додають 20 мл хімічно чистого стерильного гліцерину. Штами типу gravis утворюють сірувато-чорні колонії з дещо порізаними краями, типу mitis – ростуть в вигляді дрібних блискучих чорних колоній з рівними краями.

5.Казеїново-вугільний агар (КУА) – напівситетичне поживне середовище на казеїновому гідролізаті, використовується для культивування збудників кашлюку.

Казеїновий кислотний гідролізат вноситься в 1000 мл дистильованої води (150-170 мг амінного азоту). Крім того, вноситься NaCl (0,75-0,9%), КН2РО4 – 0,5г, MgCl2 – 0,4 г, СаСl2 – 0,01 г, FeSO4 – 0,01 г, CuSO4 – 0,005 г, крохмал розчинний – 1,5г, цистеїн або цистин –- 0,03 г, дріжжевий гідролізат – 100 мл, агар-агар – 25 г, активоване вугілля – 2 г. Перед розлиттям поживне середовище сумлінно струшують для рівномірного розподілення вугілля.

6.Середовище Борде-Жангу – також використовується для культивування бордетелл. 1 кг високоякісно очищеної картоплі нарізають скибочками, заливають 2 літрами дистильованої води і варять до пом’якшення. До картоплі, що розварилася додають 4% гліцерину, кип’ятять 5 хвилин, потім рідину фільтрують через марлю. Додають до попереднього об’єму гарячу дистильовану воду, пропускаючи її через марлю з картоплею. Осад (крохмаль) повинен складати в бульйоні приблизно 1/3 об’єму. Окремо готують 3% водний агар. До 1 частини картопляного бульйону додають 3 частини водного агару і NaCl в концентрації 0,6%. Стерилізують. Перед використанням в розтоплене і охолоджене до 50°С середовище додають 20-30% стерильної овечої, кінської або людської крові. Ретельно перемішують і розливають в чашки Петрі.

ТЕСТИ ДЛЯ ІДЕНТИФІКАЦІЇ БАКТЕРІЙ

7.Проба на цистиназу (Пізу)

В стовпчик агару з цистином методом уколу засівають досліджувану культуру і ставлять пробірку в термостат. Через добу середовище за ходом уколу чорніє, на глибині 1 см від поверхні з’являється коричнева “хмаринка”. Так ростуть коринебактерії дифтерії. Дифтероїди та вдавано дифтерійні бактерії ніколи не утворюють “хмаринки”, хоча може спостерігатись невелике потемніння за ходом уколу.

8.Проба на уреазу (Закса)

Визначення уреази проводять посівом в середовище з сечовиною. В якості індикатора в поживне середовище вносять феноловий червоний. Одну повну петлю росту коринебактерій з будь якого середовища розтирають в пробірці з середовищем з сечовиною, закривають пробкою і ставлять на 30 хвилин в термостаті (37 гр С). За цей час сечовина розщеплюється з утворенням аміаку, котрий сильно підлужує середовище і воно набуває червоного кольору.

9.Визначення токсигенності культур C.diphtheriae методом преципітації в гелі.

На поживний агар в чашці Петрі наносять кілька паперових дисків, просочених дифтерійною антитоксичною сироваткою. Навколо дисків сіють у вигляді бляшок досліджувані чисті культури коринебактерій. Антитіла дифундують у поживне середовище. В випадку, якщо культура має токсигенні властивості, екзотоксин виділяється бактеріями в навколишнє середовище і дифундує в поживний агар, У зоні зустрічі антитіл та токсину на поверхні агару ми спостерігаємо смуги преципітації.

ІМУНОБІОЛОГІЧНІ ПРЕПАРАТИ ЛІКУВАЛЬНІ І ПРОФІЛАКТИЧНІ

10.АКДС –адсорбована на гідраті окису алюмінію асоційована вакцина, яка складається з інактивованих збудників кашлюку та анатоксинів – дифтерійного і правцевого. Препарат входить до календаря щеплень.

11.АДС – адсорбовані анатоксини збудників дибтерії та правця. Використовується для планової ревакцинації. АДС-М – препарат зі зменшеною кількістю антигенів. Використовується для осіб з порушеннями імунного статусу.

12.Дифтерійний анатоксин – моновакцина,котра може бути використана, як для планової вакцинації дорослого населення, так і по епідеміологічним показам.

13.Протидифтерійна антитоксична сироватка

Препарат отриманий шляхом гіперімунізації тварин дифтерійним анатоксином. Ефективний засіб специфічної терапії дифтерії. При його використанні треба пам’ятати правила введення сироваток, які зменшують ймовірнність виникнення анафілактичного шоку та сироваткової хвороби.

14.Протидифтерійний гамма-глобулін

Препарат містить антитоксини, здатні нейтралізувати дифтерійний екзотоксин. Представляє собою гамма-глобулінову фракцію сироватки крові гіперімунізованих тварин. Зменшена кількість баластних речовин суттєво зменшує вірогідність розвитку побічних реакцій, в першу чергу алергічних.

15.Тампон для взяття слизу з гортані і носоглотки

Тампон дещо вигнутий в нижній частині.Це дозволяє забирати матеріал (виділення слизової оболонки дихальних шляхів) з ділянок, малодоступних при використанні прямої основи тампону.