Одержання вітаміну в12 за допомогою пропіоновокислих бактерій.
У 70-х роках 20 ст. цікавість вчених привернули пропріоновокислі бактерії, відомі ще з 1906 року, які широко застосовували при виготовленні препаратів для тваринництва. Виділено 14 видів пропіоновокислих бактерій, які продукують вітамін В12. Для одержання високоочищених препаратів вітаміну В12, пропіоновокислі бактерії культивують періодичним способом на матеріалах, які містять глюкозу, казеїновий гідролізат, вітаміни, неорганічні солі, хлорид кобальту. Додавання в середовище попередника 5,6 – диметилбензимідазола стимулює швидкий синтез вітаміну. Мутант пропіоновокислих бактерій продукує до 30 мг/л вітаміна
Для одержання високого виходу вітаміну, використовують двохстадійний процес. На першій стадії, культуру вирощують в анаеробних умовах, до повної утилізації цукру. На другій стадії включають аерацію, тим самим створюючи умови для синтезу 5,6 ДМБ і перетворення етиокобаламіну в дезоксикобаламін. Обидві стадії проходять або в одному, або в двох різних ферментерах. Анаеробно вирощені клітини можна відділяти центрифугуванням та інкубувати. Додають ДМБ лише в другій стадії ферментації, так, як в його присутності утворюються повні форми вітаміну, які інгібують його синтез.
Середовище ферментації зазвичай містить глюкозу, або інвертовану мелясу (10 – 100 г/л), невелику кількість солей Fe, Mn та Mg, а також Со (10 – 100 мг/л). в середовище додають кукурузний екстракт ( 30 – 70 г/л), який включає в себе молочну та пантотенову кислоти, які підсилюють ріст бактерій. Пантотенову кислоту, яка стимулює також синтез вітаміну, рекомендують вносити в середовище додатково. Бактерії культивують при температурі 30°, підтримуючи рН на рівні 6,5 - 7,0 шляхом введення (NH4)ОН. Ферментація проходить в ферментерах 500 л, які міститимуть 340 л середовища, 7 л посівного матеріалу. У перші 80 годин культура росте під невеликим тиском N2 і при слабкому перемішуванні (без аерації). У наступні 88 годин, вмикають аерацію(2 м³/год) та переміщування. Можливі деякі варіації в культивуванні.
Вітамін В12 зберігається в клітинах бактерій, через це проводять його екстракцію: 1) виділяють вітамін із клітин і перетворюють його в ціанокобаламін, 2) виділення неочищеного продукту ( 80% чистоти), який можна використовувати в тваринництві, 3) подальша очистка до рівня 91-98% (для медичних цілей).
Для екстракції вітаміну із клітин, останніх нагрівають при 80° - 120°С протягом 10 – 30 хвилин при рН 6,1 – 8,5. Перетворення в СN-кобаламін досягають, обробляючи гарячий розчин або клітинну суспензію ціанідом, або тіоціонатом, часто в присутності NaNО2 або хлораміну В. Корриноїди сорбують на різних носіях: амберліті, активованому вугіллі, та елюірують водними спиртами або водно – фенольними сумішами. Із водних розчинів корриноїди екстрагують фенолом або крезолом або сумішшю цих спиртів з бензином, бутанолом, хлороформом.
При упарюванні різних розчинників отримують осад або кристали вітаміну В12, які розчиняють у відповідному розчиннику до потрібної концентрації. Вихід вітаміну В12 при використанні пропіоновокислих бактерій – 25 – 40 мг/л.
У процесі одержання вітаміну В12, за допомогою пропіоновокислих бактерій, застосовують дорогу антикорозійну апаратуру, важкі і дорогі поживні середовища.
Удосконалення технологічного процесу іде в напрямі здешевлення компонентів поживного середовища (заміна глюкози сульфідними лугами)та переходу з періодичного культивування на безперервний процес.
Одержання вітаміну В12 за допомогою термофільних мікроорганізмів
Для тваринництва працівниками Інституту біохімії ім. А.Н.Баха, було розроблено просту і дешеву технологію одержання вітаміну В12 . За цією технологією ферментацію здійснюють термофільні мікроорганізми, які здійснюють метанове бродіння.
На першій фазі процесу (10 – 12 днів) розвиваються термофільні зброджуючі вуглеводневу сировину бактерії (). Результатом цього є утворення жирних кислот і аміаку.
У другій фазі, коли у середовищі рН 8,5, починають переважати метанутворюючі бактерії – головні продуценти вітаміну. Збагачення середовища чистими культурами метанутворюючих бактерій збільшують вихід активних форм вітаміну В12.
Джерелом водню в живильному середовищі є ацетонбутилова і спиртова барда, яку надають заводи, що переробляють зерно і мелясу. Для оптимізації живильного середовища до нього додають сполуки кобальту (хлорид кобальту – 4 г/ м³), який входить в склад молекули вітаміну В12 та субстрати для росту метанутворюючих бактерій – низькомолекулярні жирні кислоти і нижчі спирти, що дозволяє значно підвищити вихід вітаміну.
Підготовлені середовища звільняють в декантаторі від грубих частинок і безперервно додають в нижню частину ферментера ( метантенка ) ємністю 4200м³, одночасно в ферментер поступає посівний матеріал культури мікроорганізмів, які спочатку вирощують у спеціальних апаратах.
Для вирощування продуцента потрібні анаеробні умови, так як навіть сліди кисню подавляють ріст бактерій. При створенні анаеробних умов в середовище подають СО2, чи гази, які виділяються у процесі ферментації. Кожного дня із метантенка відбирають 25 – 30% об’єму середовища. Продукт ферментації стабілізують, підкислюючи соляною чи фосфорною кислотою до рН 6,3 – 6,5 і додаванням 0,2 – 0,25% сульфату натрію, що попереджує руйнування вітаміну при тепловій обробці, особливо в лужному середовищі. Потім відібрана частина культуральної рідини дегазується і концентрується у вакуумі: концентрат висушується в розпилювальній сушилці до вологості 10 – 15% і змішується з наповнювачем. Готовий кормовий препарат, який має назву КМВ–12 (концентрат мікробний вітамін), до складу його входять крім вітаміну В12. (2,5%), ще й В1, В2, В6, а також пантотенова і фолієва кислоти, біотин, незамінні амінокислоти.
Процес промислового одержання вітаміну В12 – приклад безвідходної і екологічно-чистої технології.
Одержання вітаміну В12 за допомогою бактерій Pseudomonas denitrificans:
Ряд штамів родини Pseudomonas утворює в значних кількостях В12 , але найчастіше використовують мутант Pseudomonas denitrificans, у якого в результаті мутагенезу рівень вітаміну В12 вдалося підняти з 0,6 мг/л до 60 мг/л.
Чистий вітамін В12 отримують в результаті проведення слідуючих стадій:
Культуральну рідину з клітинами Pseudomonas denitrificans (3,3л) нагрівають 30 хвилин при 120°С, після чого охолоджують, доводять рН до 8,5, додають KCN, перемішують протягом 16 годин при температурі 25°С, додають ZnCl2 (200г), доводять рН до 8,0, перемішують і фільтрують.
Отриманий фільтрат піддають триразовій екстракції 350 мл крезолу і вуглецевого тетрахлориду. Отримують органічний екстракт І.
До органічного екстракту І додають 500мл н-бутанолу і піддають триразовій екстракції 100 мл води. Отримують водний екстракт.
Водний екстракт піддають триразовій екстракції 30 мл суміші крезолу і вуглецевого тетрахлориду. Одержують органічний екстракт ІІ.
До органічного екстракту ІІ додають200 мл ацетону і 120 мл ефіру. Отримують неочищений вітамін В12.
Неочищений вітамін розчиняють в 10 мл метанолу, проводять хроматографію на активованому алюмінії (4г), потім піддають елюції 2% оцтовою кислотою в метанолі, осаджують ефіром. Таким чином отримують чистий вітамін В12.
Виробництво β-каротину
Каротиноїди містяться в багатьох тваринних і рослинних тканинах. Щороку у природі їх утворюється близько 100 млн. т. і більша їх частина міститься у фруктах, овочах, молочних і морських продуктах, які мають відповідний колір: від жовтого до яскраво-червоного.
Одержують каротиноїди виключно з рослин, або мікроорганізмів. Мікробіологічне виробництво β-каротину є у багатьох країнах: Франції, Польщі, США, Росії тощо. β-каротин – провітамін А, перетворюється у вітамін в мембранах тонкого кишківника людини і запасається в печінці (у вигляді ефір-пальмітату). Потреба людини 1,5 – 2 мг на добу, при нестачі розвивається куряча сліпота, спостерігаються зміни шкіри, волосся, нігтів.
Використовується переважно як харчовий барвник для забарвлення маргаринів, сиру, кремів, десертів. Також використовують як кормову добавку у тваринництві (КПМК – кормовий препарат мікробіологічного каротину), що покращує колір жовтка яєць, курчат, збільшує приріст, несучість курей, репродуктивні властивості великої рогатої худоби. Каротиноїди застосовують в косметичній галузі і в медицині як дубильний препарат. Їх дія пов’язана із взаємодією з вільними радикалами в організмі, тому вони здійснюють профілактику деяких форм злоякісних пухлин.
У промисловості каротиноїди одержували в основному хімічним синтезом, а також з червоної пальмової олії, борошна люцерни, з моркви (1кг містить 60 мкг β-каротину).
Все більше розвивається і набирає обертів мікробний синтез. Препарат за біологічною активністю значно кращий хімічного, але останній у декілька разів дешевший ніж з рослинної сировини.
Структура: Відомо більше 400 природних каротиноїдів, з них біологічно активні лише 10. Це ненасичені похідні ізопрену містять 40 атомів вуглецю. На обох кінцях β-каротинового ланцюга є β-іонові кільцеві структури, які обумовлюють провітамінну активність. З нього можна одержати 2 молекули вітаміну А.
Продуценти: β-каротин утворюють переважно мікроскопічні гриби і водорості, ксантофіли, бактерії і гриби. Самий високий вихід одержують з гриба Blaneslea trispora (1 г біомаси утворює 3-8 тис. мкг вітаміна)- гетероталічний гриб, що утворює (+), і (-) міцелій. β-каротин утворює (-) штам, але значно менше ніж при змішуванні (+) і (-) штамів.
Двохстадійний процес розроблений в Італії ( фірма Farmoceutici). Попередньо спори змішують із стерильним піском, висівають (+) - на косий агар, а потім в колбу з оптимальним середовищем. (-) – в колбу – після чого їх змішують у ферментері 170л.
На 1 стадії: (накопичення біомаси)
Поживне середовище: кукурудзяний екстракт, кукурудзяний крохмаль К2НРО4, тіамін, вода.
Культура повністю забезпечена N, кількість якого в другому періоді синтезу каротину знижують; інкубація 40 годин, температура 26°С з перемішуванням і аерацією.
2 стадія - 800 л. ферментер, інкубація 185 годин, 26°С, перемішування і аерація.
Середовище – барда (залишок спиртового виробництва), кукурудзяний крохмаль, соєва олія, насіння бавовни, МnSO4, тіамін, керосин (ізопіазид, етоксихін). Через 48 годин вносять 1 г/л β-іонона, 5 мл/л керосину і безперервно розчин глюкози, всього 42 г/л. Активатори біосинтезу . β-каротину – ізопіазид, β-іонон, олія, керосин, дія останнього виражається у збільшенні проникності клітинної стінки, що попереджує інгібування синтезу кінцевим продуктом. Оскільки β-каротин нестабільний, до міцелію додають антиоксиданти: α-нафтол, аскорбінова кислота, лецитин. Після закінчення ферментації міцелій відділяють, висушують і стабілізують. Може використовуватись як КПМК. Для вивільнення каротиноїдів з висушеного під вакуумом і подрібненого міцелію, використовують гідрокарбонові і хлоргідрокарбонові розчинники. Потім переосадження і кристалізація у розчинниках ( етанол-бензин + етанол). 75 – 92% каротиноїдів – це β-каротини. Іноді екстрагують олією.
Вихід продукту 50 мг/100мл культурованої рідини КПМК до 1430 мг/л каротину.
Для збільшення рентабельності мікробіологічного способу необхідне удосконалення продуцента і здешевлення середовища.
Мікробіологічним методом одержують і вітамін D2 (ергокальциферол), використовуючи дешеву вуглеводневу сировину і стимулюючи синтез дією на культуру дріжджів ультрафіолетовим промінням.