Питательные среды для культивирования бруцелл

Для выделения и поддержания культур бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон, печеночно-глюкозо-глицериновый буль­он, картофельный агар, мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар, печеночно-глюкозо-глицериновый агар, сывороточно-декстрозный агар, эритрит-агар, агар Альбими и другие среды. При выделе­нии бруцелл из загрязненного материала в среды добавляют генцианвиолет 1:100-250 тыс., малахитовый зеленый — 1 500 тыс., кристаллвиолет — 1:100 тыс.

Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ). К 610 см³ мясной воды добавляют 305 см³ печеночного настоя, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида. Кипятят 60 мин, водой доводят объем до первоначального. Фильтруют, разливают в пробирки (колбы), стерилизуют при 110°С 30 мин.

Печеночно-глюкозо-глицериновый агар. К 900 см³ печеночного настоя добавляют 9 г пептона, 5 г натрия хлорида, 25 г агар-агара. Ва­рят в автоклаве 60 мин при 100-110°С. Фильтруют, устанавливают рН 7-7,2. Добавляют 20 г глюкозы и 25 см³ глицерина. Разливают в пробирки, стерилизуют при 110°С 30 мин.

Печеночно-глюкозо-глицериновый бульон готовят так же, как и предыдущую среду, но агар не добавляют.

Печеночно-сывороточный и печеночно-аминопептидный агар. К 1 л печеночного настоя добавляют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, 17 см³ 10%-ного раствора натрия двууглекислого. Авто-клавируют при 115°С 20 мин. Фильтруют, устанавливают рН 7-7,2 Добавляют 10 г глюкозы и 20 см³ глицерина. Разливают по сосудам, стерилизуют при 110°С 20 мин. Перед использованием в расплавлен­ную и охлажденную до 45°С среду вносят 10-20% стерильной сыво­ротки крови крупного рогатого скота или 10-15% аминопептида Среду разливают в пробирки или бактериологические чашки.

Полужидкий печеночно-сывороточный и печеночно-амино­пептид­ный агар. К 500 см³ мясной воды добавляют 500 см³ печеночного настоя, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида и 2 г агар-агара. Кипятят до расплавления агара. Устанавливают рН 7-7,2. Разливают по сосудам и стери­лизуют при 115°С 30 мин. Перед использованием в подогретый до 45°С агар добавляют 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота или барана или аминопептида.

Сывороточно-декстрозный агар. К 835 см³ дистиллированной воды добавляют 20 г агар-агара, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 165 см³ мясной воды. Кипятят до расплавления агара. Фильтруют, устанавли­вают рН 7,4. Разливают в колбы и стерилизуют 15 мин при 115°С. Перед использованием в расплавленный и охлажденный до 45°С агар вносят 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади, 1% декстрозы.

Картофельный агар. В 1 л дистиллированной воды 15 мин варят 500 г очищенного и мелко нарезанного картофеля. Отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят объем водой до 1 л. Добавляют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 25 г агар-агара, кипятят до расплав­ления агара. Устанавливают рН 7,2. Агар оставляют для застывания; прозрачную верхнюю часть отрезают, расплавляют и фильтруют через ватный фильтр. Корректируют рН до 7,2. Добавляют 10 г глюкозы и 30 см глицерина. Разливают по колбам или пробиркам. Стерили­зуют при 115°С 20 мин. Готовая смесь должна иметь рН 6,8.

Среда Альбими. В 1 л дистиллированной воды растворяют 2 г пепто­на, 1 г декстрозы, 5 г натрия хлорида, 0,1 г натрия бисульфата. Добав­ляют 2 см³ дрожжевого аутолизата. При изготовлении плотной среды добавляют 2-2,5% промытого агар-агара. Стерилизуют при 115°С 30 мин.

Заменитель среды Альбими. К 1 л дистиллированной воды добавля­ют 20 г пептона Дифко, 20 см³ дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г промытого агар-агара или агара Дифко. Устанавливают рН 7,3, Нагре­вают до расплавления агара, фильтруют через ватный фильтр. В горя­чую среду добавляют 1 г глюкозы и 0,1 г натрия бисульфата. Корректи­руют рН до 7,2—7,3. Разливают в колбы или пробирки, стерилизуют 20 мин при 110°С.

Для приготовления дрожжевой воды в 1 л дистиллированной воды суспендируют 1 кг пекарских (хлебных) дрожжей, кипятят 5-10 мин, фильтруют через плотный фильтр. Хранят в темном месте под хлоро­формом не более 2 нед.

Селективные среды для выделения бруцелл из молока и других материалов (рецепты фирмы Oxoid). К расплавленным и охлажденным до 55-60°С агаровым средам (сывороточно-декстрозный или кровя­ной агары с 5% лошадиной сыворотки и 1% декстрозы) добавляют следующие антибиотики (из расчета на 1 л среды) полимиксина В — 500 ИЕ, бацитрацина – 25 000 ИЕ, циклогексимида — 100 мг, налидиксовой кислоты — 5 мг, нистатина — 100 000 ИЕ и ванкомицина — 20 мг. Антибиотики суспендируют в 10 см³ метанола. Вносят суспензию в среду и тщательно перемешивают.

Среда с красителями для дифференциации видов бруцелл. В пред­варительном опыте с использованием эталонных культур бруцелл разных видов определяют необходимую концентрацию красителей в среде, позволяющую дифференцировать виды.

В 20 см³ этанола растирают 0,1 г тионина и отдельно — основного фуксина. Доводят объем красок до 100 см³ дистиллированной водой. Полученные разведения красителей 1:10 000 добавляют в расплавлен­ный и охлажденный до 45-60°С сывороточно-декстрозный агар, пере­мешивают и разливают в чашки Петри.

Готовят суспензию из 48-часовой агаровой культуры исследуемо­го штамма бруцелл на 0,8%-ном растворе натрия хлорида концентра­цией 10¹⁰ бактериальных клеток в 1 см. Одну каплю суспензии засе­вают штрихом на агар с красителем (отдельно с тионином и фукси­ном). Одновременно эту суспензию засевают на агар без красителя. Инкубируют до появления роста культуры на агаре без красителей. Учитывают результат по наличию роста на агаре с красителями.

Дифференциация S- и R-колоний бруцелл по Уайту-Вильсону. На подсушенный в течение 24 ч агар Альбими в чашке Петри засевают исследуемую культуру бруцелл и инкубируют при 37°С до появле­ния колоний. Затем на колонии наливают водный раствор кристаллвиолета и выдерживают 15 с. Раствор краски сливают в чашку с дезин­фицирующим раствором, а колонии рассматривают под лупой (или при малом увеличении микроскопа). Колонии S-формы светлого, а R-формы — фиолетового цвета.

Печеночный настой. К 1л водопроводной воды добавля­ют 500 г фарша из свежей печени крупного рогатого скота. Настаива­ют 3 ч при 25-30°С или 6-10 ч при 4°С. Кипятят, помешивая, 1-2 ч, доливают водой до первоначального объема. Осевший фарш удаля­ют. Настой фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в кол­бы и стерилизуют при 115°С 20 мин.

Мясная вода. К 1л водопроводной воды добавляют 500 г фарша из свежего мяса крупного рогатого скота. Настаивают при 4°С 15-18 ч. Фарш удаляют. Настой кипятят 30-40 мин, доливают водой до первоначального объема. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в колбы. Стерилизуют при 120°С 20 мин.