Лабораторная диагностика

Материалы для исследования – кровь, СМЖ, слизь из зева, пунктаты увеличенных лимфатических узлов, у новорожденных дополнительно – меконий, пупочная кровь; секционный материал — кусочки мозга, печени, селезенки, лимфатические узлы. Посевы рекомендуется делать в первые 7-10 сут болезни; кровь (10мл) и СМЖ (2-5 мл) засева­ют на 100-150 мл глюкозного, глюкозо-печеночного или глюкозо-глицеринового бульона; инкубируют при температуре 37°С до 3 нед. При посеве на глюкозо-кровяной агар отби­рают типичные колонии (прозрачные или роговидные), дающие гемолиз. Также можно проводить посев на триптозный агар и просматривать чашки под микроскопом при косом освещении — суточные колонии листерий имеют сине-зеленую окраску.

Для целей диагностики и типизации Listeria monocytogenes можно использовать еще одну оригинальную схему бактериологического выделения и идентификации, предложенную Д.А. Васильевым.

Схема бактериологического выделения Listeria monocytogenes

Общие положения

Листериоз – инфекционное заболевание из группы зооантропонозов, характеризующееся полиморфностью клинического проявления, в последнее время как пищевая инфекция людей с тенденцией к генерализации, септикопиеемии, а так же поражению различных органов и систем жизнедеятельности у людей и животных.

Листериоз относится к числу широко распространенных в мире инфекций, что обусловлено выраженной адаптационной способностью возбудителя. Исследования трех последних десятилетий позволили сформулировать заключение о повсеместном распространении данной инфекции в России.

Материалы для исследования

В бактериологическую лабораторию направляют не менее 200 грамм исследуемого субстрата, упакованного в водонепроницаемую тару и желательно в первые 1-3 часа после отбора. Если время доставки образцов свыше указанного срока, то материал допускается направлять в замороженном виде в термосе со льдом.

Рисунок 9. Принципиальная схема выделения Listeria monocytogenes

Порядок исследования материала

Бактериологическое исследование проводят в соответствии с прилагаемой ниже схемой.

Первый этап (24-48 часа). Изучаемый пищевой продукт (не менее 25 г.) измельчают и смешивают со средой накопления в соотношении 1:8 (1 часть продукта и 8 частей среды) встряхивают в течение 1 минуты и культивируют при 28°С 24-48 часов. После чего изучаемый образец отправляют в холодильник на +4°С.

Состав накопительной среды:

1. Питательный бульон – 16,0 г.

2. Д-глюкоза – 5,0 г.

3. Динатрий фосфат – 2,5 г.

4. Аммоний-железо сульфат – 50 мг.

5. Хлористый натрий – 5 г.

6. Хлористый литий – 15 г.

7. Полимиксин «В» – 500 тыс. ед.

8. Дистиллированная вода – 1000 мл.

Первые шесть компонентов разводят в дистиллированной воде, доводя рН до 7,3 – 7,4 стерилизуют автоклавированием при +120°С – 15 минут. Охлаждают и добавляют раствор полимиксина «В» в 10 мл физ. раствора. Компоненты с 2 по 5 необходимы для поддержания жизнедеятельности листерий, компоненты 6 и 7 составляют систему, замедляющую рост посторонней микрофлоры.

Второй этап. Через указанные сроки 1 мл полученной бактериальной суспензии смешивают с 5 мл 0,1-0,3%-ного раствора КОН (растворенного в 5%-ном NaCl) встряхивают и через минуту высевают на селективный агар.

В качестве твердой селективной питательной среды для выделения листерий наилучшие результаты из дешевых, доступных по составу дала среда имеющую следующую рецептуру:

1. Агар «Д» – 30,0 г.

2. Хлористый натрий – 5,0 г.

3. Д – глюкоза – 5,0 г.

4. Аммоний-железо (III) сульфат – 50,0 мг

5. Глицин – 2,0 г.

6. Хлористый литий – 15,0 г.

7. Полимиксин «В» – 500 тыс. ед.

8. Дистиллированная вода – 1000 мл.

Компоненты с 1 по 6 растворяют в дистиллированной воде доводя рН до 7,3-7,4, стерилизуют автоклавированием при +121°С – 15 минут. Охлаждают до +50°С и добавляют раствор полимиксина в 10 мл физ. раствора. Селективными агентами являются компоненты с 5 по 7. Хлористый литий и глицин ингибировали рост энтеробактерий и бактерий семейства Pseudomones. Полимиксин подавлял рост энтерококков.

Третий этап. Через 24-48 часов культивирования при температуре 22°С проводят клонирование и идентификацию выросших колоний по тестам указанным в таблице 12.

Таблица 12. Характеристика биологических свойств листерий, штаммов первой серогруппы (шт. 766) и второй серогруппы (шт. 634)

	Шт. 766	Шт. 634
Окраска по Граму	+	+
Подвижность: 37°С	–	–
22°С	+	+
В-гемолиз	+	+
Каталаза	+	+
ферментация:
лактозы	+	+
сахарозы	+	+
глюкозы	+	+
мальтозы	+	+
маннита	–	–
рамнозы	+	+
Дульцита	–	–
Арабинозы	–	–
Инозита	–	–
Сорбита	–	–
Салицин	+	+
Галактозы	–	–
Ксилозы	–	–
Раффинозы	–	–
Эскулина	+	+
Фруктозы	+	+
Коньюктивальная проба (проба Антона)	+	+

Оптимальным решением является постановка на исследование не одной пробы исследуемого образца, а целой серии в 10-12 проб. При исследовании по третьему этапу проводят одновременно постановку по всем необходимым тестам, что сокращает сроки исследования выделенной культуры.