Лабораторная диагностика
Наиболее достоверный результат, подтверждающий диагноз, получают выделением иерсиний из патологического материала. Данные бактериологических исследований не менее важны для дифференциальной диагностики заболеваний, протекающих с лихорадкой, лимфаденопатиями и энтероколитами.
Рисунок 16. Схема бактериологического выделения возбудителя чумы
Исследуемый материал. У больного с подозрением на чуму исследуют отделяемое бубона (при бубонной форме), содержимое язвы или других кожных поражений (кожная форма), мокроту и слизь из зева (легочная форма), кровь (все формы), фекалии и СМЖ (при поражениях кишечника или мозговых оболочек). Материал следует получить до начала антибиотикотерапии. Выделение Y.pestis проводят по стандартной схеме (рис. 16).
Рисунок 17. Схема бактериологического выделения возбудителя иерсениозов
Возбудитель кишечного иерсиниоза может быть выделен из крови (Y. enterocolitica) и из кала (Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica) по стандартной (рис. 17) и по оригинальной схеме, предложенной Д.А. Васильевым, Д.А. Померанцевым.
Схема бактериологического выделения и идентификации Yersinia enterocolitica.
(Д.А. Васильев, Д.А. Померанцев).
Общие положения.
Иерсиниоз –острое инфекционное заболевание из группы зооантропонозов, характеризующееся полиморфностью клинического проявления, в первую очередь как пищевая инфекция людей с тенденцией к генерализации, септикопиеемии, а так же поражению различных органов и систем жизнедеятельности у людей и животных.
Иерсиниоз относится к числу широко распространенных в мире инфекций, что обусловленно выраженной адаптационной способностью возбудителя. Исследования последнего десятилетия позволили сформулировать заключение о повсеместном распространении данной инфекции в России.
Так как по международной классификации кишечный иерсининиоз входит в число 4, наиболее распространенных пищевых инфекций, опережая по некоторым показателям сальмонеллез, то основным путем заражения людей являются пищевые продукты и в частности мясопродукты.
Материалы для исследования
В бактериологическую лабораторию направляют не менее 200 грамм исследуемого субстрата, упакованного в водонепроницаемую тару и желательно в первые 1-3 часа после отбора. Если время доставки образцов свыше указанного срока, то материал допускается направлять в замороженном виде в термосе со льдом.
Порядок исследования материала
Бактериологическое исследование проводят в соответствии с прилагаемой ниже схемой.
Первый этап (24-48 часов). Изучаемый субстрат (не менее 25 г.) измельчают и смешивают со средой накопления – солевой – фосфатно-буферный раствор (0,85% NaCl, КН2РО4 – 0,45 г, Na2НРО4 –6,34г., Н2О – 1000 мл.) с 1% спиртовым раствором генцианвиолетта, в соотношении 1:5 (1 часть продукта и 5 частей среды) встряхивают в течение 1 минуты и культивируют при +4°С 24 – 48 часов. Через указанные сроки (24 часа в первую очередь, с дальнейшим сохранением в холодильнике исследуемой суспензии) 1мл полученной бактериальной суспензии смешивают с 5 мл 0,5%-ного раствора КОН ( приготовленного по следующей методике: готовят стерильный 40% раствор КОН, из него в пробирку содержащую 7,9 мл., 5% стерильного раствора NaCl, добавляют 0,1 мл.) встряхивают и через минуту высевают на селективный агар. Параллельно на селективные среде высевают и со среды накопления хранящейся в холодильнике, причем посев делают с верхней трети суспензии (но не с поверхности) не взбалтывая среду.
Второй этап. Рост на селективных средах (24-48 часов).
В качестве селективного агара используют несколько сред.
На агаре Эндо рост изучаемых иерсиний– колонии мелкие, гладкие, слегка прозрачные. К 36 часам, удается их детальнее рассмотреть.
Среда Серова дает хорошие результаты к 36 - 48 часам – колонии интенсивно-красного цвета, матовые шероховатые, центр выпуклый.
Однако недостаток данной селективной среды — достаточно сложный по структуре состав: глюкоза –0,5 г., мочевина – 0,5г., молибденово-кислый аммоний – 0,1 г., углекислый натрий безводный – 0,1 г., 30% водный, стерильный раствор сухой желчи – 2 мл., 1,6% водный раствор краски конгорот – 0,9 мл., 1,0% водный раствор генцианвиолета – 0,1 мл., сухой питательный агар –4,5 г., дистиллированная вода – 100 мл.. Не все реактивы можно найти.
Среда Иркутского НИИПЧИ (аналог БТС), она выпускается как коммерческая и имеет следующий состав: желчь медицинская 20 мл., раствор NaOH 4% – 10-12 капель, сухой питательный агар – 35 г., глюкоза –10 г.. мочевина 5 г., 1,6% спиртовой раствор бромтимолового синего – 8 мл., дистиллированная вода 1000 мл. В случае трудностей с ее приобретением ее состав достаточно доступен и она легко готовится в лаборатории. К 1 литру воды добавляют сухой питательный агар, медицинскую желчь, автоклавируют 20 минут при 0,5 атм. После охлаждения до 80°С добавляют глюкозу, мочевину, индикатор бром тимоловый синий и все смешивают. Среда зеленоватого цвета. И хранится неделю. Иерсинии, разлагая мочевину, изменяют цвет среды на сине-зеленый, а колонии будут синего цвета. Те микроорганизмы, что не разлагают мочевину, растут в виде желтых колоний. Через 24-48 часов культивирования при температуре 22°С проводят идентификацию выросших колоний. Преимущество среды и в том, что выявляет уреазную активность.
Третий этап. Клонирование, выделение чистой культуры (от 48 часов), биохимическая идентификация выделенных штаммов.
Из выделенной, по морфологии и окраске, колони частично берут бакмассу для мазка, окрашивают по Граму. Если при микроскопии наблюдают грамотрицательные, полиморфные палочки, с закругленными краями, без спор и капсул, одиночные, возможно кокковидные, реже овоидные, то, оставшуюся бакмассу колонии переносят в МПБ, ресуспендируют, подращивают при 24-26°С и проводят идентификацию по биохимическим тестам.
При положительной уреазной активности, ферментации и отсутствии газообразовании глюкозы, в первые 24 часа при 37°С, исключают все газообразующие энтеробактериии родов: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Enterobacter, Hafnia. Способность ферментировать арабинозу исключает еще два рода – Proteus, Serratia, отсутствие ферментации инозита исключает род Klebssiella. Внутри родовая дифференциация Yersinia проводится с использованием следующих биохимических тестов: положительные результаты ферментации сахарозы, целлобиозы, сорбозы, сорбита и отрицательные показатели ферментации рамнозы, мелибиозы, рафиннозы при положительном тесте на уреазу и подвижность при 25°С могут свидетельствовать о принадлежности выделяемой культуры к бактериям вида Yersinia enterocolitica.
Внутривидовая дифференциация выделенных культур Yersinia enterocolitica делается с целью типирования биовариантов и проводится по следующим тестам: положительные результаты на индол, ксилозу, салицин, трегалозу указывают на принадлежность штаммов к 1 биовару, отрицательные результаты по этим тестам свидетельствуют о принадлежности штаммов к 5 биовару. Штаммы 2 биовара из указанных 4-х тестов дают отрицательные показатели только по салицину. Штаммы 4 биоварианта имеют из данных 4-х тестов положительный результат только по трегалозе. Штаммы 3 биовара дают отрицательные результаты по тестам на салицин и индол и положительные результаты по тестам на ксилозу и трегалозу. Биоварианты 2, 3, 4 являются наиболее патогенными для человека.
При исследовании по третьему этапу проводят одновременно постановку по всем необходимым тестам, что сокращает сроки исследования выделенной культуры.