Определение белков в листьях растений при помощи цветных реакций (по методу м. X. Чайлахяна)

Современные исследования свидетельствуют о том, что в про­цессе фотосинтеза, наряду с образованием углеводов, образуются и белковые соединения. Чтобы убедиться в этом, используют цветные реакции на белки - биуретовую и ксантопротеиновую.

Ход работы:

Материалы и оборудование. Растение пеларгонии или фасо­ли, элек­троплитка, химические стаканы на 200 мл, колба на 250 мл, шта­тив и зажимы к нему, фарфоровые чашки, пинцет, скрепки, вата, 96 %-ный этиловый спирт, 5 %-ный раствор CuSO·5H₂O, 10 %-ный раствор NaOH, HNO₃ разбавленная (1:1), водный аммиак (раз­ведение 1:2), чашки Петри, химические стаканы, водяная баня.

Берут растения с пестрыми листьями (традесканция, пеларгония) помещают в стакан, наливают водопроводную воду и выдерживают на водяной бане 2-3 мин. пос­ле закипания, а затем в 96 %-ном спирте до полного удаления хло­рофилла. Обесцвеченные листья смачивают водой и раскладывают в чашки Петри. На них проводят цветные реакции.

а) Биуретовая реакция.

Листья погружают в 5 %-ный раствор медного купороса на 1 час, затем промывают водой и заливают 10 %-ным раствором NaOH. Листья приобретают фиолетовую окраску, что говорит о присутствии белков, а также соединений, которые имеют пептидные связи.

б) Ксантопротеиновая реакция.

Обесцвеченные листья заливают азотной кислотой (разведе­ние 1:1) на 15-30 мин. Они окрашиваются в желтый цвет. Эту реакцию дают все белки, кроме проламинов.

При добавлении аммиака (разведение 1:2) желтый цвет пере­ходит в оранжевый, после чего аммиак сливают.

На основании проведенных цветных реакций можно нагляд­но показать, что синтез белковых соединений обуславливается на­личием хлорофилла в листьях, так как те части листа, которые не имели хлорофилла, окрашиваются в оранжевый цвет незначи­тельно.

Количественное определение белковых фракций

(по А. И. Ермакову)

Физико-химические свойства белковых фракций. В семенах и вегетативных органах растений образуются и накапливаются разнообразные группы белковых веществ. Каждый белок характеризуется не только последовательностью отдельных аминокислот в моле­куле белка и количественным соотношением их в белках, но и структурными особенностями более высоких порядков (сте­пенью скрученности, полимерности).

Важнейшим свойством белков является их неодинаковая растворимость в различных растворах. Эта способность свя­зана с общим строением белкового комплекса его физико-хи­мическими связями с другими веществами в растительных клет­ках, а также с составом аминокислот. Определение белковых фракций считают существенным показателем качества белков растений и особенно показателем их биологической при­роды.

Одним из главных свойств альбуминов семян является способность растворяться в воде и выпадать в осадок в изоэлектрической точке.

Глобулины растворяются в очень слабых растворах нейтральных солей (5-10 %), переходят в воднорастворимую фракцию вместе с альбуминами и выпадают в осадок при диализе против дистиллированной. Легкорастворимые глобулины в суммарном белковом комплексе семян бобовых и масличных культур составляют большой процент.

В семенах злаковых растений есть группа белков, растворимых в 70 - 80 %-ном спирте - проламины (пшеницы, ячменя и др.)

Разделение и количественное определение белковых фрак­ций.

Принцип метода определения белковых фракций заключает­ся в извлечении белков различными растворами, применяемыми в двух неодинаковых последовательностях:

1) солевыми, ще­лочными и спиртовыми;

2) солевыми и спиртовыми.

При такой последовательности можно определить 2 различные группы спирторастворимых белков. С солевыми растворами поступают двояко: большую часть подвергают диализу; в небольшой части растворов определяют суммарный азот, а также азот после осаждения белков.

Величина навески и объем вытяжки, получаемой при извле­чении отдельных белков, зависят от предполагаемых количеств отдельных фракций. Определение фракционного состава белков производят в воздушно-сухих семенах и в свежих вегетативных органах с целью оценки качества белков сортов отдельных культур.

Полнота извлечения белков зависит от степени измельче­ния материала, от полноты разрушения клеток, объема раство­рителей и числа обработок. Чтобы обеспечить полноту извле­чения белков, необходимо муку, а тем более другой материал тщательно растереть в ступке со стеклянным песком (чтобы полнее разрушить ткани). Сумма извлеченного азота в виде белковых и небелковых фракций должна быть не меньше 85-90 % от общего количества азота. Проверить результаты сле­дует по количеству азота в остатке после извлечения раствори­телями.

Реактивы и аппаратура: 1) 1 М раствор КС1; 2) 70 %-ный раствор спир­та; 3) раствор для осаждения белков; 4) реактивы для определения азота по полумикрометоду (Кьельдаля); 5) центрифуга (с пробирками 50-100 см³); 6) диализатор и целлофановые мешочки для диализа; 7) прибор для механического встряхивания; 8) мерные колбы на 100; 200; 250 см³; 9) стеклянный песок (битую химическую посуду размельчают на шаровой мельнице или в ступке, отсевают фракцию сначала через сито с отверстиями 1,75 мм., а затем отсеянную часть отделяют от мелких частиц, просевая через сито с отверстиями 0,5 мм).

Ход работы. Извлечение белков раствором со­ли из богатых водой растительных частей. От­вешивают навески измельченных овощей столько, чтобы в них содержалось около 5 г сухих веществ (для корнеплодов около 50 г, клубней картофеля и листьев около 25 г). Навески расти­рают в фарфоровой ступке с 5 г стеклянного песка в присут­ствии 1 М раствора хлористого калия. Последнего берут на 5-10 см³ меньше объема навески (объем навески условно мо­жно принять за величины, взятые по весу).

Извлечение белков из семян раствором соли. Навески по 2,5 или 5±0,01 г (в зависимости от объема центрифужных пробирок) хорошо размельченных семян помещают в ступку диаметром 11 см, прибавляют 2 г толченого стекла и материал тщательно растирают, после этого приливают 3-5 см³ раствора 1 М хлористого калия и далее растирают до тонкой кашицы, затем добавляют еще немного того же раст­вора и дополнительно растирают. Общий объем растворителя - 80 см³ отмеривают мерным цилиндром и из него приливают частями.

Полученную суспензию переносят в центрифужную пробирку на 50 или 100 см³ и добавляют раствор хлористого калия до 16-кратного количества по отношению к навеске (до 50 или 100 см³). Пробирки закрывают резиновыми пробками и встряхивают 15 минут в аппарате для встряхивания или вручную. Через 15 минут осадок отделяют на центрифуге при 4 тыс. оборотах в течение 10 минут.

Экстракт сливают в мерную колбу или мерный цилиндр на 250 см³ через воронку с ватным фильтром, который поме­щают в горлышко воронки. Извлечение 1 М раствором хлори­стого калия повторяют еще 3 раза, но с 8-10-кратным коли­чеством растворителя. После прибавления новой порции растворителя осадок в пробирке хорошо перемешивают палочкой. Экстракцию солевым раствором заканчивают промыванием остатка 20-25 см³ воды, которую после перемешивания и цент­рифугирования сливают в мерную колбу с солевыми вытяжками, и доводят объем до метки. В солевую вытяжку переходят азотсодержащие небелковые вещества, альбумины и все глобулины. Для установления их количества определяют общий азот солевой вытяжки, а затем определяют азот после осаждения всех белков, проводят диализ, если хотят определить альбумины и глобулины.

Для определения общего азота отбирают 20-25 см³ солевой вытяжки, затем из фильтрата берут пробы по 50 см³ для диализа и разделения белков.

Во всех случаях азот определяют в фильтратах. Это быстрее и удобнее, но необходимо учитывать низкие концентрации азотсодержащих веществ, оставшихся в растворе.

Во всех случаях солевая вытяжка содержит азота не менее 30 % от его суммы, а часто гораздо больше; следовательно, эта экстракция должна быть проведена очень тщательно.

После солевой экстракции извлечение можно прервать до следующего дня, если в этом есть необходимость. К остатку материала прибавляют тимол или 1 см³ толуола, перемешивают и, закрыв пробкой, оставляют до следующего утра в холодильнике.

Для определения азота небелковых и белковых веществ солевой вытяжки берут в колбы Кьельдаля на 100 см³ по 25 см³ экстракта, сжигают и определяют азот по Кьельдалю.

Диализ солевой вытяжки. В целлофановый мешочек наливают 50 см³ солевого экстракта и в качестве антисептика прибавляют тимол, затем помещают в диализатор, наполненный водой и кусками льда, и в течение рабочего дня про­пускают медленный ток водопроводной воды. На ночь диали­затор ставят в холодильник с дистиллированной водой. На сле­дующий день диализ продолжают (реакция с AgNO₃). К концу диализа в мешочке солерастворимые белки выпадут, а в растворе будут находиться только воднорастворимые белки. Не­белковые вещества (свободные аминокислоты и другие) уда­ляются.

Альбумин от осадка глобулинов отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 4 тыс. об/мин. Жидкость над осадком и промывные воды (после промывания осадка и центрифугирования) сливают в мерную колбу, доводят до метки и берут пробы для сжигания и определения азота. Осадок глобулинов тщательно переносят в другую мерную колбу на 200 см³ путем растворения в 1 М KCI и многократного смывания. Затем колбу доводят до метки этим же раствором. Берут пробы раствора, в котором находятся легко- и труднорастворимые глобулины, для сжигания и определения их азота.

Суммарное содержание белков в солевой вытяжке можно определить, не применяя диализа; в этом случае определяют азот после осаждения белков. Это упрощает работу, но не дает информации о конкретном содержании альбуминов и глобулинов. После осаждения белков раствор отфильтровывают или центрифугируют. Затем пробы по 20 или 50 см³ фильтрата сжигают и определяют небелковый азот, отгоняя аммиак в ап­парате для микроопределения.

Примечание. При необходимости определения группы легкораство­римых глобулинов извлечение белков из семян начинают водой. Для вы­деления глобулинов проводят диализ водной вытяжки. После водного извле­чения приступают к экстракции белков 1 н. KCI, как указано выше.

Извлечение белков 0,2 %-ным раствором ще­лочи. После солевого извлечения экстрагируют раствором щелочи, чтобы извлечь все оставшиеся белки (растворимые в этом растворителе). Извлечение ведут 0,2 %-ным раствором щелочи последовательно, порциями − сначала 80, а затем по 40 см³. Для этого в пробирку к остатку муки приливают 80 см³ 0,2 %-ного раствора едкого натра и после перемеши­вания стеклянной палочкой пробирку закрывают пробкой и встряхивают в течение 15 минут, а затем центрифугируют. Жидкость сливают в мерную посуду на 250 см³. Извлечение раствором щелочи производят не менее 3-4 раз. Промывают осадок водой так же, как после солевой экстракции. Объем доводят раствором щелочи до метки и берут пробы до 50 см³ для определения азота.

Извлечение белков раствором 70 %-ного спирта. Спирторастворимые белки извлекают в двух или трех сле­дующих вариантах.

1. После извлечения белков раствором KCI к остатку в центрифужных пробирках приливают 70 %-ный спирт, нагретый до 60° С (10-кратное количество для первой экстракции и 5-кратное для каждой из последующих). Пробирки закрывают пробками, которые укрепляют так, чтобы они не открывались при взбал­тывании на механическом аппарате в течение 30-60 минут. Затем вытяжку в пробирках центрифугируют 2 минуты и экст­ракт белка сливают в колбу на 100-200 см³ (семена пшеницы, ячменя, овса, ржи, кукурузы экстрагируют последовательно 3 раза). После этого в мерную колбу приливают 1-2 капли щелочи, чтобы белки не выпадали в осадок. Объем растворимых в спирте белков доводят до метки, взбалтывают и берут пробы для определения азота, используя полумакро- или полумикрометоды.

2. После извлечения белков растворами хлористого калия и затем щелочи поступают так же, как сказано в первом варианте. При этом имеют в виду, что семена проса, сорго и дру­гих просовидных содержат таких белков более 50 % от общей суммы белков в семенах; много их также в семенах отдельных сортогрупп кукурузы. В связи с этим семена этих культур обрабатывают спиртом не менее 3-4 раз и объем вытяжек этой фракции доводят до 200 см³. В остальных случаях (семена пшеницы, ячменя, овса и др.) достаточно 1-2 экстракций спиртом, где эта фракция составляет обычно не более 5 %.

3. Спирторастворимые белки извлекают сразу, без предва­рительной экстракции другими растворителями. В этом случае в экстракте находятся и свободные аминокислоты.

Из проб, взятых для определения азота, отгоняют большую часть спирта в присутствии 1 см³ крепкой H₂SO₄.

Вычисление состава азотистого комплекса. Определения азота в семенах проса (без оболочек) показали, что в 5 г семян находится 112,5 мг азота. Содержание азота в отдельных вытяжках, полученных из 5 г семян, было следую­щее: в солевой 20 мг, в щелочной (после солевой) − 28 мг, в спиртовых вытяжках: 1) после предварительного извлечения раствором КСl − 75 мг; 2) после извлечения растворами КС1 и щелочи − 62,5 мг; 3) после извлечения спиртом без предварительной экстракции водой или растворами солей − 77 мг азо­та. В солевой вытяжке из 5 г семян, после осаждения белков, содержалось 5 мг небелкового азота.

Полученные результаты позволяют вычислить в процентах от общего количества азота в семенах: азот небелковых веществ, сумму солерастворимых белков (альбуминов и глобулинов), сумму спирторастворимых белков (с выделением двух групп проламинов) и щелочерастворимых белков.

Если проведен диализ солевого экстракта, то можно отдельно вычислить содержание альбуминов и глобулинов. Па­раллельное извлечение из разных навесок, проводимое этим способом, дает хорошо совпадающие результаты.

Контрольные вопросы

1. Какие функции выполняют белки в организме?

2. Опешите первичное, вторичное и третичное строение белков.

3. Что такое незаминимые аминокислоты?

4. Какая существует классификация аминокислот по строению радикальных групп?

5. Какие особенности строеня аминокислот лежат в основе методов их определения в с оставе белков?

6. Опишите способы качественного определения состава белков.

7. Какие воздействия могут вызывать повреждения белков (их денатурацию)? Какие виды денатурации вы знаете?

8. На чем основано токсическое действие тяжелых металлов на белки?