Реакции осаждения белков

При исследовании некоторых процессов переработки с/х продукции и при установлении пищевой ценности готовой продукции определяют количественное содержание азотистых соединений (белок, аминокислоты и др.).

С этой целью белки отделяют от остальных веществ исследуемого продукта в виде осадка, а затем, после окисления осадка концентрированной серной кислотой при нагревании определяют, как правило, белковый азот. Исследуя различные реагенты н условия, можно лишить частицы белка заряда н разрушить их гидратную оболочку. При этом происходит осаждение белка.

В большинстве случаев осаждение белка сопровождается его денатурацией, глубина которой может быть различной и зависит от природы белка, вида реагента и времени его воздействия. Поэтому осаждение может быть обратимым и необратимым. При обратимом осаждении не происходит глубоких изменений белка, так что осадок белка можно повторно растворить в первоначальном растворителе. При необратимом осаждении белок претерпевает значительные изменения с нарушением структуры белковой материн.

Осаждение белка при нагревании. Большинство белков при нагревании подвергаются необратимому осаждению (необратимой денатурации). Механизм тепловой денатурации заключается в перестройке пространственной структуры белковой молекулы, в результате которой белок теряет нативные свойства, что резко уменьшает его растворимость. Некоторые белки, например, яичный, при нагревании приобретают упругость. Процесс денатурации протекает постепенно и ускоряется с повышением температуры.

Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке, т.е. при таком значении рН среды, когда белковые частицы нейтральны. Добавление к растворам белка солей (NaCI и других электролитов) ускоряет процесс осаждения белка. Добавление к растворам белка сахаров, многоатомных спиртов, альдегидов, аминов, кетонов защищает белки от свертывания. В этом случае денатурация происходит при более высокой температуре и более продолжительном нагревании.

Реактивы:

1. растворы белков;

2. 2) 1%-ный раствор СН₃СООН.

Ход определения. В две пробирки наливают по 2 мл раствора яичного белка. Содержимое первой пробирки осторожно нагревают до кипения. Во вторую пробирку добавляют 3-4 капли 1%-ного раствора уксусной кислоты, а затем также нагревают до кипения. Фиксируют время выпадения осадков в обеих пробирках.

Осаждение белка органическими растворителями. Спирты, ацетон, хлороформ и другие органические растворители осаждают белок нз раствора. Растворители разрушают водную оболочку частиц белка и тем самым понижают их устойчивость в растворе, вызывая выпадение белка в осадок. Если осаждение белка производить при комнатной температуре и осадок быстро отделить от избытка органического растворителя, то осажденный белок можно вновь растворить в воде.

При продолжительном взаимодействии белка с органическими растворителями его структура изменяется настолько глубоко, что образовавшийся белковый осадок в воде не растворяется. В присутствии нейтральных солей (NaCI и др.) осаждение белка органическими растворителями усиливается: устойчивость раствора белка снижается вследствие снятия заряда с белковой частицы.

Реактивы:

1. растворы белков;

2. 96%-ный этиловый спирт;

3. ацетон;

4. хлороформ.

Ход определения. В три пробирки наливают по 1 мл раствора яичного белка. Затем в первую пробирку приливают 2 мл 96 %-нoго этилового спирта, во вторую - 2 мл ацетона, в третью - 2 мл хлороформа. Содержимое пробирок энергично встряхивают и оставляют на 5-10 минут до выпадения белка в осадок.

Сразу же после появления осадка в первой пробирке, отливают часть содержимого пробирки и добавляют несколько миллилитров дистиллированной воды. Концентрация спирта уменьшается, и белок снова переходит в раствор.

Осаждение белков минеральными кислотами. Концентрированные минеральные кислоты (азотная, серная, соляная) вызывают резкую дегидратацию белковых частиц и нейтрализацию их заряда, при этом происходит образование комплексных соединений. Все это ведет к необратимой денатурации белка. Осадки, вызванные действиями минеральных кислот, растворяются в избытке серной и соляной кислот, но не растворяются в азотной кислоте.

Ортофосфорная кислота осадка с белками не образует.

Реактивы:

1. растворы белков;

2. НС1, концентрированная;

3. HNO₃ , концентрированная;

4. H₂SO₄, концентрированная.

Ход определения. В три пробирки наливают по 1 мл кислот. Пробирки наклоняют под углом 45° и осторожно, по стенке, приливают раствор белка. На границе растворов белка и кислоты появляется белое кольцо образовавшегося осадка. Пробирки осторожно встряхивают и в каждую добавляют ту же кислоту.

Наблюдают растворение осадков белков.

Осаждение белков солями тяжелых металлов. Белки осаждаются солями меди, свинца, ртути, цинка, серебра и других тяжелых металлов. Характер взаимодействия белков с ионами тяжелых металлов достаточно сложен. Прежде всего, это образование комплексных соединений, нерастворимых в воде, но растворяющихся в избытке раствора соли (кроме AgN0₃ и HgCl₂). Соли тяжелых металлов, адсорбируясь на белковых мицеллах, изменяют их электрический заряд (вплоть до полной нейтрализации). Денатурация белков солями тяжелых металлов вызывает глубокие нарушения структуры макромолекул белка. Изменение положения пептидных связей происходит в результате разрыва, в основном, дисульфидных связей.

Дисульфидным связям принадлежит существенная роль в поддержании вторичной и третичной структур белка, определяемых упорядоченным расположением гибких полипептидных связей и конфигурацией их в пространстве. Разрыв их влечет за собой необратимую денатурацию белка.

Растворение осадка белка в избытке раствора соли объясняется явлением адсорбционной пептизации. Ионы металла, адсорбируясь на поверхности белковых мицелл, придают им положительные заряды. Одноименно заряженные мицеллы отталкиваются, что способствует их переходу из осадка в раствор.

Реактивы:

1. растворы белков;

2. 5%-ный раствор (СН₃СОО)₂РЬ;

3. 2,5%-ный раствор AgNO₃;

4. 5%-ный раствор CuSO₄.

Ход определения. В три пробирки наливают по 1-2 мл раствора белка. Прибавляют по каплям в первую пробирку раствор ацетата свинца, во вторую - раствор сульфата меди, в третью - раствор нитрата серебра. Наблюдают образование осадков. В первую н вторую пробирки с осадками, образованными ацетатом свинца н сульфатом меди соответственно, добавляют избыток растворов этих солей. Наблюдают растворение осадков.