1. Выделение, учет и идентификация м/о.

1. Методы выделения и учета бактерий.

1. На твердые питательные среды (широко применим, легок, позволяет выделять чистые культуры. Наносим суспензию на поверхность питательной среды, в результате деления одной клетки возникает колония, считаем, радуемся. Питательные среды: Чапека, Эшби, крахмало-аммиачная, мясо-пептонный агар, голодный агар, агар Локхида, почвенный агар).

2. Метод предельного разведения (смотрим последнее разбавление, когда еще обнаруживаются м/о).

3. Микробиологический анализ образцов ризосферных растений (на корнях в сотни-тысячи больше бактерий, надо больше разбавлять).

2. Анализ физиологических функций бактерий (придумывают разные среды, которые реагировали бы с азотом, серой и тд.).

1. Участвующих в круговороте азота. Нитрификация – превращение аммония в азотистую и азотную кислоту. Аммонификация – разложение азотсодержащих с выделением аммиака. Азотфиксаторы, денитрофикаторы. (для азотфиксаторов – среда Федорова, анаэробных азотфиксаторов – среда Виноградского и Емцева, для азоспирилл – среда Доберейнер, для нитрифицирующих – среда Сориано, Уокера, Уатсона).

2. Учавствующих в круговороте углерода (аэробное и анаэробное разложение целлюлозы, разложение крахмала, лигнина, хитина и тд.).

3. Метаногены – получают энергию за счет образования метана (требуется анаэробная техника, иначе все бастро подохнут, среды готовят под током углекислоты, использующиеся газы – азот и углекислота).

4. Участвующие в окислении и восстановлении серы.

5. Способные мобилизировать фосфор.

6. Железобактерии.

3. Методы выделения и идентификации таксонов. Пигментация: одни на свету желтые, другие желтые только в окислительных условиях, третьи –оранжевые и тд. + грам-положительные и грам-отрицательные.

4. Методы хемотаксономического анализа (выделение сахаров, аминокислот, ацетильных и гликолильных групп и тд.).

5. Метод определения анаэробных бактерий (используют окислительно-восстановительные красители: в окисленном состоянии окрашены, в востановленном бесцветны).

6. Идентификация микроскопических грибов (обычно по морфологическим признакам (в перую очередь половых структур) разных таксонов).

7. Идентификация дрожжей (не как грибы, потому что одноклеточные. На плотные питательные среды).

2. Методы изучения динамики микробных популяций в почве

1. Иммунофлуорисцентная микроскопия.

2. Антибиотикоустойчивые варианты (получают устойчивый вариант м/о, а все другие дохнут. Таким образом, получает элективную среду для определения определенного штамма м/о).

3. Метод мембранных камер (ставят фильтры, смотрят сколько спор на фильтрах, сколько гифов проросло и тд.).

2. Микробные препараты в растениеводстве

Источники:

Биология почв, стр 182-185, 400-406

Дятлова К.Д., «Микробные препараты в растениеводстве», Соросовский журнал, 2001 г. - в основном.

Плюсы, относительно хим. препаратов:

• Комплексное положительное действие

• Высокая эффективность - > применение в невысоких дозах

• Отсутствие накопительных эффектов (легко разрушаются)

• «Самовоспроизводимость», синтез нужных веществ непосредственно на месте.

Микробные препараты, применяющиеся в растениеводстве, можно условно разделить на две группы. Первая – препараты для оптимизации питания и активизации роста растений (на основе азотфиксирующих, фосфатмобилизирующих микроорганизмов), вторая группа – препараты для защиты растений от болезней, вредителей и сорняков (биофунгициды, биоинсектициды, биогербициды).

Микробные культуры, являющиеся основой препаратов для растениеводства, должны отвечать следующим требованиям (условно):

• отсутствие патогенных и токсических свойств, опасных для человека, теплокровных животных, полезных насекомых, рыб, почвенных микроорганизмов;

• максимальное проявление полезных свойств: азотфиксации, фосфатмобилизации, антагонизма к патогенам и т.д.

• технологичность в производстве – микроорганизмы должны иметь высокую скорость роста в условиях производственного культивирования на недорогих питательных средах, устойчивость к лизогенным фагам; препараты должны быть удобны при транспортировании и использовании.

Используются 2 типа препаратов:

1. микробная масса (улучшение питания и борьба с вредителями и патогенами)

2. метаболиты микроорганизмов (регуляция жизнедеятельности растения и борьба с вредителями).

Применение микробной массы

• Повышение обеспеченности азотом. Внесение симбиотических и несимбиотических азотфиксаторов.

Симбиотические.

В основном препараты на основе Rhizobium (первым в чистую культуру выделил Бейринк, первый препарат – нитрагин, 1896 г, Германия), для бобовых. Необходимо использовать штаммы с высокой степенью образования клубеньков и активностью азотфиксации, превышающими таковые у диких Rhizobium. Тщательный подбор препарата ввиду видовой специфичности бактерий. Еще роды клубеньковые бактерии:

• Sinorhizobium – те же бобовые (вика, люцерна) + соевые

• Mezorhizobium

• Bradyrhizobium – соя, медленнорастущие бактерии.

Отечественный препарат на основе Rhizobium – ризоторфин. Торф подготавливают (нейтрализуют реакцию среды, вносят питательные элементы, увлажняют), запаковывают в пакеты и стерилизуют гамма-лучами. Далее при помощи шприца в пакет вносят чистую культуру бактерий, подращивают колонию в течение 2-х недель. Ризоторфин может храниться в холодильнике до 6-8 месяцев. Вносят под бобовые путем инокуляции семян: семена перед посадкой смачивают «растворам препарата» в количестве 200 г сухого в-ва на гектарную норму семян. Результат – увеличение урожая (бобовых, до 50%), увеличение содержания азота в почве.

Другие симбионты-азотфиксаторы: актиномицеты рода Frankia на корнях ольхи, облепихи, лоха, цианобактерия Anaboena azollae в полостях листьев водного папоротника Azolla pinnata.

Несимбиотические (ассоциативные азотфиксаторы).

Ассоциативную азотфиксацию осуществляют около 30 видов свободноживущих почвенных МО (цианобактерии, актиномицеты, бактерии). Основное преимущество препаратов на их основе – возможность внесения практически под любые культуры. Чаще всего используют препарат азотобактерин (Azotobacter chroococcum). Улучшает азотное питание растений, стимулирует выработку витаминов группы В, ауксинов и т.д.

Препарат на основе ассоциативных азотфиксирующих бактерий флавобактерин повышает урожай зерновых на 0,3 – 0,5 т/га, кормовых – на 1,4 – 1,8 т/га и т.д., улучшается качество продукции, повышается содержание белка.

Ризоэнтерин повышает урожай риса, озимой пшеницы и озимой ржи на 200 – 500 кг/га.

Вышеперечисленные препараты не полностью удовлетворяют потребности растений в азоте, но заменяют 40-60 кг минерального азота. Рекомендуется их применение вместе с небольшими дозами минеральных удобрений.

• Улучшение иммобилизации фосфора. Препараты на основе бактерий фосфобактерин и АМБ в настоящее время не используются. Наиболее перспективно - применение препаратов на основе микоризообразующих грибов.

• Борьба с вредителями.

Препараты для борьбы с насекомыми в основном включают энтомопатогенную тюрингинскую бациллу Bacillus thuringiensis. Бактерия образует 2 токсина: β-экзотоксин – опасный для млекопитающих, и -эндотоксин – опасный только для насекомых. Поэтому в производстве используют штаммы, продуцирующие лишь эндотоксин. Он действует на листогрызущих насекомых, преимущественно на личинок чешуекрылых, безвредный для млекопитающих и перепончатокрылых. В настоящее время в применяют несколько препаратов на основе Bacillus thuringiensis для защиты растений от бабочек, колорадского жука.

Из грибных препаратов для борьбы с насекомыми используют боверин и вертициллин. Боверин – бластоспоры энтомопатогенного гриба Bauveria bassiana, который легко культивируется, поражает более 200 видов насекомых и применяется против табачного триписа для защиты огурцов и помидоров в закрытом грунте. Вертициллин – бластоспоры гриба Verticillum lecanii – используется против табачной белокрылки. Также используется хищный гриб Arthrobotrys oligospora – против нематод (препарат - нематофагин). Контроль численности нематод затруднен из-за их скрытого образа жизни, особенно в теплицах, где нельзя применять большое количество пестицидов - > нематофагин очень ценен. Работает, как и другие мико-препараты, только во влажной среде, вследствие чего не используется в открытом грунте.

• Борьба с фитопатогенами.

Принцип – занять, как можно раньше, нишу фитопатогенов полезными/нейтральными микроорганизмами. Способы: предварительная обработка семян (инокуляция), опрыскивание проростков или обработка корней при пересадке суспензией, содержащей нужные МО.

Применяют: фитоспорин (Bacillus subtilis, на пшенице и картофеле), псевдобактерин-2 (Pseudomonas aureofaciens, на пшенице и овощах закрытого грунта), фитофлавин (Streptomyces lavendulae), триходермин и т.д. Препараты существенно снижают заболеваемость растений грибными инфекциями (фитофтороз, мучнистая роса и т.д.) и бактериозами. Как правило, микроорганизмы – антагонисты фитопатогенов выделяют стимулирующие рост вещества, что положительно сказывается на урожае.

Также в эту группу можно отнести организмы-антиобледенители. Эпифитная психротрофная бактерия Pseudomonas syringae весной развивается на почках, листьях и цветах плодовых деревьев и выделят метаболит, кристаллы которого могу служить центрами кристаллизации в случае заморозков. В результате возникают поражения плодов и листьев. Получены мутантные формы бактерии, не образующие пагубного вещества. При угрозе заморозков цветущие сады опрыскивают мутантными бактериями, заселяющими растение и препяствующими развитию других форм.

Применение метаболитов

• Стимуляторы роста растений

Наиболее распространенные препараты – на основе гиббереловой кислоты, продукта гриба Gibberella fujikuroi. Применяется для активации роста, стимуляции образования завязи и ускорения созревания. Применение гиббереллинов требует усиленного минерального питания.

Также используются препараты комплексного стимулирующего действия на основе ауксинов, цитокининов и витаминов. Применяются на зерновых, овощах, картофеле, для стимуляции прорастания и роста, повышения устойчивости к заболеваниям.

• Борьба с вредителями

Для борьбы с макроорганизмами используют фитоверм – метаболит грибов, который активен против широкого круга вредителей (колорадский жук, паутинный клещ, нематоды и т.д.)

• Пленки для защиты корней

Применение микробных слизей для предохранения корней растения от высыхания, т.к. полисахаридные пленки не пропускают воду, но проницаемы для кислорода.