2.5.7. Эксклюзионная хроматография

Эксклюзионная хроматография представляет собой вариант жид­костной хроматографии, в котором разделение происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся внут­ри пор сорбента, и растворителем, протекающим между его части­цами. Неподвижной фазой служит пористое тело или гель, а раз­личное удерживание веществ обусловлено различиями в размерах молекул веществ, их форме и способности проникать в поры непод­вижной фазы. В названии метода отражен механизм процесса, от английского термина "Size Exclusion", означающего "исключение по размеру". Эксклюзионная хроматография, в которой неподвижной фазой служит гель, называется гель-проникающая хроматография (ГПХ)

В отличие от остальных вариантов ВЭЖХ, где разделение идет за счет различного взаимодействия компонентов с поверхностью сорбен­та, роль твердого наполнителя в эксклюзионной хроматографии зак­лючается только в формировании пор определенного размера, а не­подвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры.

Принципиальной особенностью метода является возможность разделения молекул по их размеру в растворе в диапазоне практи­чески любых молекулярных масс – от 10² до 10⁸, что делает его не­заменимым для исследования синтетических высокомолекулярных веществ и биополимеров.

Рассмотрим принципиаяьные основы метода. Объем эксклюзионной колонки можно выразить суммой трех слагаемых:

V_t=V_м +V_i+V_d, (2.41)

где V_м - мертвый объем (объем растворителя между частицами сор­бента, иначе говоря, объем подвижной фазы; V_i− объем пор, занятый растворителем (объем неподвижной фазы); V_d - объем матрицы сорбента без учета пор.

Полный объем растворителя в колонке V_t представляет собой сумму обьемов подвижной и неподвижной фаз:

V_t= V_м +V_i. (2.42)

Удерживание молекул в эксклюзионкой колонке определяется вероятностью их диффузии в поры и зависит главным образом от соотношения размеров молекул и пор, что схематически показано на рис. 1.6. Коэффициент распределения К_d, как и в других вариан­тах жидкостной хроматографии, представляет собой отношение концентраций вещества в неподвижной и подвижной фазах:

K_d = С/С₀. (2.43)

Так как подвижная и неподвижная фазы имеют одинаковый со­став, то К_d вещества, для которого обе фазы одинаково доступны, равен единице. Эта ситуация реализуется для молекул с самыми ма­лыми размерами (в том числе и молекул растворителя), которые про­никают во все поры (см. рис. 1.20.), и поэтому движутся через колон­ку наиболее медленно. Их удерживаемый объем равен полному объе­му растворителя V_t. Все молекулы, размер которых больше размера пор сорбента, не могут попасть в них (полная эксклюзия) и проходят по каналам между частицами. Они элюируются из колонки с одним и тем же удерживаемым объемом, равным объему подвижной фазы V_м. Коэффициент распределения для этих молекул равен нулю.

Рис. 1-20. Принцип разделения и детектирования пробы в эксклюзиоиной хроматографии.

А - ввод образца; В - разделение по размерам; С -выход крупных макромолекул; D - выход мелких макромолекул

Связь между удерживаемым объемом и молекулярной массой (или размером молекул) образца описывается частной калибровоч­ной кривой (рис. 1.21.), т.е. каждый конкретный сорбент характе­ризуется своей калибровочной кривой, по которой оценивают об­ласть разделяемых на нем молекулярных масс. Точка А соответ­ствует пределу эксклюзии, или мертвому объему колонки V_м. Все молекулы, масса которых больше, чем в точке А, будут элюироваться одним пиком с удерживаемым объемом V_м. Точка В отра­жает предел проникания, и все молекулы, масса которых меньше, чем в точке В, также будут выходить из колонки одним пиком с удерживаемым объемом V. Между точками А и В располагается диапазон селективного разделения. Соответствующий ему объем

V_i= V_t – V_м (2.45)

принято называют рабочим объемом колонки. Отрезок CD представляет собой линейный участок частной калибровочной кривой, постро­енной в координатах V_R=IgM. Этот участок описывается уравнением

V_{R =} С₁ –С₂ lgМ, (2.46)

где C₁ - отрезок, отсекаемый на оси ординат продолжением отрез­ка CD, C₂ - тангенс угла наклона этого отрезка к оси ординат.

Рис. 1.21. Эксклюзионная калибровочная кривая. Отрезок СD –линейный участок частной калибровочной кривой. V_M – мертвый объем, V_i – рабочий объем колонки

Ве­личину С₂, называют разделительной емкостью колонки; ее выра­жают числом миллилитров растворителя, приходящегося на один порядок изменения молекулярной массы. Чем больше разделитель­ная емкость, тем селективнее разделение в данном диапазоне масс. В нелинейных областях калибровочной кривой (участки АС и BD) в связи с уменьшением С₂ эффективность фракционирования за- метно снижается. Кроме того, нелинейная связь между IgM и V_R существенно усложняет обработку данных и снижает точность ре­зультатов. Поэтому стремятся выбирать колонку (или набор коло­нок) так, чтобы разделение анализируемого полимера протекало в пределах линейного участка калибровочной кривой.

Если какое-либо вещество элюируется с удерживаемым объе­мом больше V_i, то это указывает на проявление других механизмов разделения (чаще всего адсорбционного). Адсорбционные эффек­ты обычно проявляются на жестких сорбентах, но иногда наблю­даются и на полужестких гелях, видимо, из-за повышенного срод­ства к матрице геля. Примером, может служить адсорбция арома­тических соединений на стиролдивинилбензольных гелях.

В эксклюзионной хроматографии стремятся полностью подавить адсорбционные и другие побочные эффекты, так как они, особенно при исследовании молекулярно-массового распределения (ММР) полимеров, могут суще­ственно исказить результаты анализа. Одним из мешающих факторов является гидродинамический режим хроматографирования, в котором роль непод­вижной фазы играют стенки ко­лонки (канала). Разделение смеси макромолекул или частиц происходит вследствие различия скоростей протекания подвиж­ной фазы вдоль оси канала и у его стенок, а также за счет рас­пределения разделяемых частиц по сечению канала в соответ­ствии с их размером.

Принципиальными отличиями зкеклюзионной хроматографии от других вариантов являются априори известная продолжитель­ность анализа в конкретной используемой системе, возможность предсказания порядка элюирования компонентов по размеру их молекул, примерно одинаковая ширина пиков во всем диапазоне селективного разделения и уверенность в выходе всех компонен­тов пробы за достаточно короткий промежуток времени, соответ­ствующий объему V_i. Данный метод применяют преимущественно для исследования ММР полимеров и анализа макромолекул био­логического происхождения (белки, нуклеиновые кислоты и т.д.), но указанные особенности делают его чрезвычайно перспективным для анализа низкомолекулярных примесей в полимерах и предва­рительного разделения проб неизвестного состава. Получаемая при этом информация существенно облегчает выбор наилучшего ва­рианта ВЭЖХ для анализа данной пробы. Кроме того, микропре­паративное эксклюзионное разделение часто используют в каче­стве первого этапа при разделении сложных смесей путем комби­нации различных видов ВЭЖХ.

В эксклюзионной хроматографии полимеров предъявляются наиболее жесткие требования к стабильности потока подвижной фазы. Точность результатов в эксклюзионной хроматографии по­лимеров заметно зависит от температуры. При ее изменении на 10°С ошибка определения средних молекулярных масс превышает ±10%.

Поэтому в данном варианте ВЭЖХ обязательно термостатирование разделительной системы. Как правило, достаточна точ­ность поддержания температуры ±1^оС в пределах до 80-I00⁰С. В некоторых случаях, например, при анализе полиэтилена и поли­пропилена, рабочая температура составляет 135-150⁰С. Наиболее распространенным детектором в эксклюзионной хроматографии полимеров является дифференциальный рефрактометр.

Выбор сорбентов, обеспечивающих оптимальные условия для решения конкретной аналитической задачи, проводят в несколько этапов. Матрица геля должна быть химически инертной, т.е. в ходе зкеклюзионной хроматографии не должно происходить химичес­кое связывание разделяемых макромолекул. При разделении бел­ков, ферментов, нуклеиновых кислот, при контакте с матрицей не должна происходить их денатурация. Первоначально на основе данных о химическом составе или растворимости анализируемых веществ устанавливают, какой вариант процесса следует применить хроматографию в водных системах или в органических раство­рителях, что в значительной степени определяет тип необходимо­го сорбента. Разделение веществ низкой и средней полярности в органических растворителях можно успешно осуществить как на полужестких, так и на жестких гелях. Исследование ММР гидро­фобных пoлимеров, содержащих полярные группы, чаще прово­дят на колонках со стиролдивинилбензольными гелями, так как в этом случае практически не проявляются адсорбционные эффекты и не требуется добавка модификаторов к подвижной фазе, что зна­чительно упрощает подготовку и регенерацию растворителя.

Для работы в водных системах используют главным образом жесткие сорбенты, иногда – полужесткие гели специальных типов. По калибровочным кривым или данным о диапазоне фракциони­рования выбирают сорбент нужной пористости с учетом имеющих­ся сведений о молекулярной массе образца. Если анализируемая смесь содержит вещества, отличающиеся по молекулярной массе не более чем на 2-2.5 порядка, то обычно удается разделить их на колонках с одним размером пор. При более широком диапазоне масс применяют наборы из нескольких колонок с сор­бентами различной пористости. Ориентировочно калибровочную зависимость в этом случае получают сложением кривых для от­дельных сорбентов.

Растворители, применяемые в эксклюзионной хроматографии, должны удовлетворять следующим основным требованиям:

1. полностью растворять образец при температуре разделения;

1. смачивать поверхность сорбента;

2. предотвращать адсорбцию (и другие взаимодействия) разде­ляемых веществ с поверхностью сорбента;

3. обеспечивать максимально высокую чувствительность детек­тирования;

2. иметь низкую вязкость и токсичность.

Кроме того, при анализе полимеров имеет существенное значе­ние термодинамическое качество растворителя: весьма желатель­но, чтобы он был "хорошим" по отношению к разделяемому поли­меру и матрице геля, т.е. были максимально выражены концентра­ционные эффекты.

Растворимость образца обычно является главным лимитирую­щим фактором, ограничивающим ассортимент пригодных подвиж­ных фаз. Наилучшим органическим растворителем для эксклюзионной хроматографии синтетических полимеров по комплексу свойств является тетрагидрофуран (ТГФ). Он обладает уникальной растворяющей спо­собностью, низкой вязкостью и токсичностью, лучше многих дру­гих растворителей совместим со стиролдивинилбензольными геля­ми и обеспечивает высокую чувствительность детек­тирования при использовании рефрактометра или УФ-детектора в области до 220 им. Для анализа высокополярных и нерастворимых в ТГФ полимеров (полиамиды, полиакрилонитрил, полиэтилентерефталат, полиуретаны и др.) обычно используют диметилформамид или м-крезол, а разделение полимеров низкой по­лярности, например, различных каучуков и полисилоксанов, часто проводят в толуоле или хлороформе. Последний является также одним из лучших растворителей при работе с ИК-детектором. о-дихлорбензол и 1,2,4-трихлорбензол применяют для высокотемпе­ратурной хроматографии полиолефинов (обычно при 135 ⁰С), ко­торые в других условиях не растворяются. Эти растворители имеют очень высокий показатель преломления, поэтому иногда их целесо­образно использовать вместо тетрагидрофурана для анализа поли­меров с низким коэффициентом преломления, что позволяет повы­сить чувствительность при детектировании рефрактометром.

Для предотвращения окисления растворителей и полужестких гелей в условиях высокотемпературной эксклюзионной хроматог­рафии к о-дихлорбензолу и 1,2,4-трихлорбензолу добавляют анти­окислители (иоиол, сантонокс R и др.).

Жесткие сорбенты совместимы с любыми подвижными фаза­ми, имеющими рН<8-8.5. При более высоких значениях рН силикагель начинает растворяться и колонка необратимо теряет эффек­тивность. Стиролдивинилбензольные гели совместимы в основном с элюентами умеренной полярности. Для работы на колонках с μ-стирогелем (от l000 Ǻ и выше) пригодны тетрагидрофуран, арома­тические и хлорированные углеводороды, гексан, циклогексан, диоксан,трифторэтанол, гексафторпропанол и диметилформамид.

Степень набухания частиц геля в различных растворителях нео­динакова, поэтому замена элюента в колонках с данными сорбента­ми может привести к снижению зффективности за счет изменения объема геля и образования пустот. При использовании неподходя­щих растворителей (ацетон, спирты) происходит столь сильная усад­ка геля, что колонка оказывается безнадежно испорченной. У сор­бентов с малым размером пор (типа μ-стирогеля 100 Е и 500 Е) такая усадка наблюдается как в полярных, так и в неполярных растворите­лях, поэтому с ними, кроме того, нельзя работать в насыщенных уг­леводородах, фторированных спиртах и даметилформамиде. Удоб­ным выходом из положения, является исполь­зование отдельных наборов колонок для каждого применяемого ра­створителя. Некоторые фирмы с этой целью выпускают колонки с одним и тем же размером пор, заполненные разными растворителя­ми: тетрагидрофураном, толуолом, хлороформом и ДМФА.

При разделении макромолекул основной вклад в размывание полосы определяется затрудненной массопередачей. К сожалению, многие из применяемых элюентов имеют высокую вязкость. Для снижения вязкости (а также для улучшения растворимости) эксклюзионную хроматографию часто проводят при повышенных температурах, что существенно улучшает эффективность хроматографической системы.

Анализ большинства полимеров на жестких гелях часто осложня­ется их адсорбцией. Для подавления адсорбции обычно используют растворители, которые адсорбируются на насадке колонки сильнее, чем анализируемые вещества. Если по каким-либо причинам это не­возможно, то подвижную фазу модифицируют добавкой 0.1-2% по­лярного модификатора, например тетрагидрофурана. Значительно более сильными модификаторами являются этиленгликоль и полигликоли с различной молекулярной массой (ПЭГ-200, ПЭГ-400, карбовакс 20 М). Иногда, например, при анализе поликислот в диметилформамиде, требуется добавка достаточно сильных кислот. Сле­дует отметить, что полностью устранить адсорбцию добавкой моди­фикаторов удается не всегда. В таких случаях нужно использовать полужесткие гели. Некоторые полимеры хорошо растворяются толь­ко в высоко полярных растворителях (ацетон, диметилсульфоксид и т. п.), несовместимых со стиролдивинилбензольными гелями. При их разделении на жестких сорбентах выбор растворителя проводят в соответствии с общими принципами, изложенными выше.

Свои характерные особенности имеет эксклюзионная хроматог­рафия в водных средах. Из-за специфики многих разделяемых сис­тем (белки, ферменты, полисахариды, полиэлектролиты и др.) и разнообразия применяемых сорбентов существует очень много ва­риаций состава ПФ для подавления различных нежелательных эф­фектов. В качестве сорбентов применяют декстрановые гели (сефадексы), полиакриламидные, оксиакрилметакрилатные гели, гели агарозы и др.

В процессе эксклюзионного хроматографирования поведение макромолекул определяется в первую очередь их гидро­динамическими размерами, а характерной особенностью белков, ферментов и синтетических полиэлектролитов является зависи­мость размеров макромолекул от рН и ионной силы раствора. Чем меньше значение рН и ионной силы раствора, тем выгоднее стано­вятся развернутые конформации макромолекул (так называемое полиэлектролитное набухание). В этом случае среднестатистичес­кие размеры растут, что приводит к уменьшению объемов удержи­вания в режиме эксклюзионной хроматографии. Общими приемами модификации является добавка различных солей и применение буферных растворов с определенным значением рН. В частности, поддержание рН<4 дает возможность подавить слабую ионообмен­ную активность силикагелей, обусловленную присутствием на их поверхности кислых силанольных групп. Требуемая ионная сила подвижной фазы достигается при концентрации буферного раство­ра 0,05-0,6 М; оптимальную концентрацию подбирают эксперимен­тально. Для предотвращения ионообменной сорбции катионных соединений наиболее часто используют такой активный модифи­катор, как тетраметиламмонийфосфат при рН=3. Однако при раз­делении некоторых белков могут проявляться гидрофобные взаи­модействия, в свою очередь осложняющие эксклюзионный меха­низм разделения. Те же эффекты иногда проявляются и при работе с дезактивированными гидрофильными сорбентами. Для их уст­ранения к растворителю добавляют метанол. Иногда в водную под­вижную фазу вводят полярные органические растворители, полигликоли, кислоты, основания и поверхностно-активные вещества.

Важнейшей областью применения эксклюзионной хроматогра­фии является исследование высокомолекулярных соединений. При­менительно к синтетическим полимерам этот метод за короткий срок занял главенствующее положение для определения их молекулярно-массовых характеристик и интенсивно используется для изуче­ния других видов неоднородности. В химии биополимеров эксклю-эионную хроматографию широко применяют для фракционирова­ния макромолекул и определения их молекулярной массы.

Принципиальная черта эксклюзионной хроматографии высоко­молекулярных синтетических полимеров заключается в невозмож­ности разделения смеси на индивидуальные соединения. Эти веще­ства представляют собой смесь полимергомологов с различной сте­пенью полимеризации и соответственно с разными молекулярны­ми массами М_i. Молекулярную массу таких смесей можно оценить некоторой средней величиной, которая зависит от способа усредне­ния. Содержание молекул каждой молекулярной массы М_i опреде­ляют либо по их численной доле в общем числе полимерных моле­кул, либо по массовой доле в их общей массе. Обычно полимер ха­рактеризуют найденными этими способами средними величинами, которые называют соответственно среднечисленной М_n и среднемассовой M_w молекулярной массой. Значения М_n дают, например, криоскопия, осмометрия, эбулиоскопия, а значения M_w- светорас­сеяние и ультрацентрифугирование.

Если обозначить число молекул с молекулярной массой М_i через N_i то общую массу полимера можно выразить через ΣM_iN_i , численную долю молекул с массой М_i через N_i /ΣN_i , а массовую долю молекул с массой М_i -через f_i =М_iN_i /ΣМ_iМ_i . Чтобы определить часть общей массы полимера, соответствующую этим долям, их умножают на М.

Пpocсуммировав полученные значения для всех величин i, полу­чают средние молекулярные массы:

(2.47)

(2.48)

Отношение M_w/M_n характеризует полидисперсность полимера.

На практике молекулярную массу полимеров часто определя­ют методом вискозиметрии. Средневязкостную молекулярную мас­су находят по уравнению Марка - Куна - Хаувинка:

[η]=K_ηM_η^a, (2.49)

где [η] − характеристическая вязкость; К_η , а - константы для дан­ной системы полимер - растворитель при данной температуре.

Величина М_η описывается уравнением

M_η=(ΣM_i^af_i ) ^1/a. (2.50)

Как правило, величины средних молекулярных масс удовлетво­ряют неравенству

^М_w ^>М_η ^>М_n^. (2.51)

Обычно полимерный образец характеризуют комплексом зна­чений M_w M_η M_n и M_w/M_η но этого может быть недостаточно. Наи­более полную информацию о молекулярно-массовой неоднород­ности образца дают кривые ММР. Типичная хроматограмма, по­лученная в процессе эсклюзионного разделения, представляет со­бой достаточно плавную кривую с одним или несколькими макси­мумами. Из этой кривой с использованием калибровочной зависи­мости и соответствующих расчетов определяют значения средних молекулярных характеристик и ММР полимера в дифференциаль­ной или интегральной форме.