2.5.5. Аффинная хроматография

Методом афинной хроматографии разделяют полипептиды, белки и другие макромолекулы биологически активных веществ. Разделение происходит за счет раз­личия в их биоспецифическом взааимодействии с комплементарны­ми сорбционньши центрами неподвижной фазы. По сути это ва­риант лигандообменной хроматографии, применение которого необходимо, если важно сохранить активность, повысить выход и степень очистки препаративно выделяемого компонента.

Для того чтобы сорбировать и десорбировать белки, полипептиды и другие макромолекулы без их денатурации, неподвижная фаза должна быть гидрофильной, а функциональные группы легко доступны для больших молекул. Матрица, используемая для получения аффинных адсорбен­тов, также должна соответствовать ряду требований: матрица должна иметь открытую и крупнопористую структуру и состоять из жестких сферических частиц, однородных по размеру и пористости; частицы должны быть химически и биологически инертными, но в то же время легко образовывать производные предпочтительно при комнат­ной температуре и в водной среде; в идеальном случае эти хи­мические производные должны обеспечивать иммобилизацию лигандов, быть стабильными в течение определенного времени и не приводить к разрушению ни носителя, ни лиганда, особен­но если последний — белок; для проведения современных экс­периментов матрица должна выдерживать повышенное давле­ние и хранение при низких температурах.

Для афиниой хроматографии выпускают материалы с различ­ными реакционно-способными группами. В качестве матрицы слу­жат разнообразные гели на основе агарозы или полиакриламида.

Агароза – это очищенный линейный со­держащий галактозу (рис. 18) аэрогель-ксерогелевый коллоид, выделяемый из агара. Агароза характеризуется хорошей гелеобразующей способностью; она относительно биологически инертна и поэтому удобна в качестве носителей не только для аффинной хроматографии, но также и для гель-фильтрации. Структурная целостность, жесткость и пористость агарозного геля определяются его вторичной структурой, характери­зующейся наличием нековалентных взаимодействий (водород­ных связей) между различными агарозными цепями.

Рис. 18. Повторяющееся структурное звено агарозы. Для ясности водо­родные атомы не указаны.	Рис. 19. Линейная полиакриламидная цепь

Полиакриламидные гели стабильны в диапазоне рН 1–10 и при использовании обычных элюентов. Они не содержат заря­женных групп, и поэтому ионообменные взаимодействия с хроматографируемыми веществами минимальны. Полиакриламид­ные гели биологически инертны, и вследствие этого не подвер­жены микробной атаке. После соответствующей химической обработки на основе полиакриламидных гелей можно получить твердые носители, удобные для присоединения ряда лигаидов. Недостаточная механиче­ская прочность полиакриламида ограничивает его применение в качестве матрицы для аффинной хроматографии.

Более устойчивости к повышенному давлению (до 3 бар) трисакрилы — синтетические гели, которые получаются полимеризацией мономера N-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола (рис. 20). Структура получаемого высокомоле­кулярного соединения представлена на рис. 21.

Рис. 20. Мономер для получения гелей трисакрила Рис. 21. Структура трисакриловых ионообменников. R = NHCH2COOH (карбоксиметилтрисакрил), NH(CH2)2NEt2 (диэтиламиноэтилтрисакрил), NHCH2CH2CH2S03H (сульфопропилтрисакрил), NH2 (незамещенный трисакрил).

Благодаря наличию трех гидроксиметильных групп и одной алкиламидной группы в каждом повторяющемся звене полимеры имеют высокую гидрофильность и удобны для разделения биологических макромолекул, особенно белков, и клеток.

Амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиольные остатки создают микроокружение, благоприятствующее подходу гидрофильных веществ (белков) из раствора к поверхности полимера. Поли­этиленовая подложка расположена под слоем гидроксиметиль­ных групп. Матрицы этого типа имеют очевидное преимущество по сравнению с носителями на основе полиакриламида и гидроксиметилметакрилата, отличающихся значительной гидрофобностью. Кроме того, шарики трисакрила не взаимодействуют с клетками, что можно объяснить неуглевод­ной природой трисакрила в отличие от классических хромато-графических матриц.

Ультрогели АсА или полиакриламид-агарозные гели (рис. 22) представляют собой трехмерную полиакриламидную решетку с заключенным в ней агарозным гелем. Выпускается пять типов АсА-гелей с различной пористостью, Для этих гелей область фракционирования по молекулярной массе находится в интервале 1000 – 1 200 000. Эти гели характеризуются наличием двух типов химических групп — гидроксильных групп агарозы и амидных групп полиакриламида, которые могут быть модифицированы для иммобилизации лигандов. Шарики ультрогеля обладают более жест­кой структурой и поэтому менее подвержены действию давле­ния, чем обычные гели, что обеспечивает более высокие скоро­сти потока.

Рис. 22. Схематическое изображение матрицы ультрогелей АсА.	Рис. 23. Структура гидроксиалкилметакрилатного геля

Гидрофильные гидроксиалкилметакрилатные гели получают полиме­ризацией суспензии гидроксиалкиловых эфиров метакриловой кислоты и алкилендиметакрилата. Путем изменения соотноше­ния концентраций мономера и инертных компонентов можно ме­нять в широких пределах число реакционноспособных групп, пористость и удельную поверхность геля. Структура геля представлена на рис. 23.

Эти гели производят под торговым названием «сферон» Гели образуют регулярные шарики с превосходной химической и физи­ческой устойчивостью. Они хорошо выдерживают хроматогра­фию под давлением и не меняют своей структуры после нагрева­ния в течение 8 ч в 1,0 М растворе гликолята натрия при 150 °С после кипячения в течение 24 ч в 20%-ной (об./об.) соляной кислоте. Сфероны биологически инертны и, подобно полиакриламидным гелям, не атакуются микроорганизмами. Их можно ис­пользовать в органических растворителях. Гидроксильные груп­пы геля имеют те же свойства, что и гидроксильные группы агарозы.

Декстран — полисахарид, состоящий из остатков α-1,6-связанной глюкозы. Ком­мерческий продукт, сефадекс, применяющийся для гель-фильт­рации, получают поперечной сшивкой декстранов эпихлорогидрином; сефадекс производится в виде сферических гранул. Наличие гидроксильных групп в полисахаридном кар­касе делает эту матрицу более гидрофильной, чем агароза. Сефадекс может обратимо набухать из сухого состояния без значительных изменений хроматографических свойств геля после повторных циклов высушивания и набухания. Сефадекс химически весьма стабилен, выдерживает обработку 0,25 М NaOH при 60 °С в течение 2 мес или 0,02 М НС1 в течение 6 мес. Однако продолжительное действие окисляющих агентов может приводить к увеличению содержа­ния карбоксильных групп.

Производные поперечно-сшитого декстрана были бы иде­альной матрицей для аффинной хроматографии, но низкая сте­пень пористости механически наиболее стабильных форм (от G-10 до G-75) сводит на нет их преимущества. Меньшая сте­пень поперечной сшивки приводит к менее стабильным гелям.

Тип геля выбирают по виду функциональных групп лиганда. Из­вестны матрицы, на которых лиганды могут быть иммобилизированы только с помощью конденсирующих агентов.

Схематично механизм разделения в афинной хроматографии представлен на рис. 24. Лиганд L фиксируется на матрице, целе­вой компонент разделяемой смеси S связывается лигандом и извле­кается из раствора, в последующей стадии элюирования комплекс разрушается и сорбат вновь переходит в раствор. Взаимодействие вещества и лиганда должно быть обратимым. Лиганд при помощи реакционно-способных групп осуществляет связь с матрицей, со­храняя при этом биоспецифическую активность. Активные центры многих биологически активных веществ часто локализованы в се­редине глобулы и недоступны для небольших структур лигандов, непосредственно связанных с матрицей. Поэтому между матрицей и лигандом часто встраивают дополнительный блок - спейсер.

Ак­тивные центры сорбента, удерживающие сорбат, обычно представляют со­бой систему ион переход­ного металла - иминодиацетатная группа, связанная с матрицей через длинные кислород- или азотсодер­жащие мостики.

Поэтому лигандообменную хроматографию белков называют также металло-хелат-афинной хроматографией.

Матрица сорбента дол­жна быть доступной для макромолекул белка, чтобы обеспечить возможность образования разнолигандных сорбционных комллексов. Этому условию удов­летворяют гели с высокой набухаемостью (сефадекс 6В, СМ-сефадекс С-50, трисакрил GF 2000 и другие так называемые аффи-гели) и слабосшитые ионообменники. В качестве подвижной фазы используют буферы в интервале значений рН от 6 (ацетатный буфер) до 8 (фосфатный буфер). Можно создать такие условия (зна­чения рН и концентрация солей), при которых взаимодействие целе­вого сорбата с лигандом будет наиболее сильным.

Десорбцию и элюирование связанного белка осуществляют тремя способами. Так, при понижении рН подвижной фазы происходит протонирование донорных групп белка и диссоциация его сорбционного комплекса. Следует помнить, что имино-диацетатные группы неподвижной фазы также способны протонироваться и терять связанный с ними ион металла, в связи с этим рН меньше 5 нежелательны. Молекулы белка можно вытеснить из сорбента лигандным обменом, исполь­зуя имидазол. Последний образует более устойчивый комплекс.

Рис. 24. Механизм разделения веществ в аффинной хроиатографии: а) иммоби-лизация лиганда на матрице; b) неко-валентное связывание целевого вещества и удаление сопутствующих примесей; с) десорбция целевого компонента

Наконец, сорбционные комплексы можно разрушить при низких рН средним по силе хелатообразующим агентом (гистидином) или сильным хелатирующим агентом (этилендиаминтетрауксусной кислотой), что приводит к освобождению белка и десорбции металла.

Этот способ эффективен для выделения ферментов, принадлежащих к классу мегаллопротеинов. Молекулы белка, не имеющие на своей поверхности остатков гистцдина или триптофана, не удерживают­ся гелем IDA-Сu²⁺, а присутствие хотя бы одного остатка гистидина в молекуле белка достаточно для его удерживания гелем IDA-Cu²⁺ при нейтральном значении рН. Дня удерживания белков, содержа­щих триптофан, требуется несколько остатков этой аминокислоты в молекуле белка. Если сорбат слишком прочно связан с лигандом, в состав буфера вводят анионы СЮ^4-, СF₃COO^-, SCN^-, CCl₃ OO ^-, разру­шающие водородные связи.

В афинной хроматографии выделяют специальный способ, на­званный афинной хроматографией на лабильных лигандах. Этот вариант разработан для того, чтобы преодолеть необратимую сор­бцию ряда специфических белков к кобаламину, который исполь­зуется в качестве привитого к матрице хелата. Вместо ковалентной иммобилизации этого хелата гидроксикобаламин или цианокобаламин предварительно координируют с матрицей сефарозы, содержащей первичные аминогруппы. Белки, специфически связывающиеся с кобаламином, селективно сорбируются на холоде (4 °С) на полученной неподвижной фазе. Затем их выделяют снова в форме комплексов с кобаламином путем повышения температуры колон­ки до 37^СС, при которой происходит разрушение координацион­ных связей с кобаламином. В методе афинной хроматографии на лабильных лигандах в ходе сорбции образуется одна координаци­онная связь, а в процессе десорбции диссоциирует другая коорди­национная связь, так что центральный ион металла вместе с дополнительным (лабильным) лигандом изменяег свою локализацию, переходя из неподвижной фазы к лабильному лиганду.

К настоящему времени разработан широкий ряд хелатообразующих сорбентов, позволяющих разделять на основе биоспецифи­ческих взаимодействий.