2.5.2. Обращенно-фазовая хроматография

Из всех вариантов ВЭЖХ обращенно-фазовый применяется в настоящее время наиболее широко, что объясняется простотой механизма сорбции и пред­сказуемостью поведения веществ на основании их строения, методической про­стотой и универсальностью метода. Термин “обращенно-фазовая хроматография” ввели Говард и Мартин в1950 г., когда ими был описано разде­ление жирных кислот с использованием жидкого парафина и н-октана в качестве неподвижных фаз. В отличие от других, ранее применявшихся систем распределительной хроматографии здесь неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная, что и послужило поводом к такому наименованию. Позднее Хорват предложил теорию обращенно-фазофой хроматографии, суть которой заключается в следующем.

Существует принципиальное различие между процессами сорбции на полярных и неполярных поверхностях. В первом случае между молекулами сорбатов и неподвижных фаз образуются ассоциаты за счет кулоновских взаимодействий или водородных связей. Во втором случае причиной удерживания сорбата на поверхности являются так называемые сольвофобные взаимодействия в подвижной фазе. Для полярных элюентов, особенно содержащих воду, характерно сильное кулоновское взаимодействие и образование водородных связей между молекулами растворителей, т.е. все молекулы в таких элюентах довольно прочно связаны межмолекулярными силами. Для того, чтобы поместить в эту среду молекулу сорбата, необходимо образование “полости” между молекулами растворителя. Энергетические затраты на образование такой “полости” лишь частично покрываются за счет взаимодействия полярных групп в молекуле сорбата с полярными молекулами растворителя. В аналогичном положении по отношению к растворителю и неполярные молекулы неподвижной фазы. С энергетической точки зрения более выгодно такое положение, когда поверхность раздела между полярной средой (растворителем) и неполярными фрагментами неподвижной фазы и молекул сорбата минимальна. Уменьшение этой поверхности достигается при сорбции (рис. 11).

Таким образом, причиной сорбции в обращенно-фазовой хроматографии служит сильное притяжение полярных молекул растворителя, как бы “прижимающее” растворенные менее полярные молекулы к неполярной поверхности. Из сказанного следует, что по сравнению с нормально-фазовой хроматографией в обращенно-фазовой роль химической природы неподвижной фазы относительно мала, так как взаимодействие сорбатсорбент ограничивается слабыми дисперсионными силами.

Рис. 11. К механизму обращенно-фазовой хроматографии: а  сорбат в растворе; б  сорбат на поверхности неподвижной фазы. Молекулы воды и органического растворителя обозначены светлыми и темными кружками соответственно.

На основании сольвофобной теории Хорват выполнил детальную интерпретации механизма сорбции на неполярных неподвижных фазах и установил количественную связь коэффициента емкости с условиями опыта и свойствами компонентов системы. Эту связь выражает следующее уравнение:

, (30)

где Ф  логарифм отношения объемов неподвижной и подвижной фаз; F_, 

 изменение свободной энергии при ассоциации компонентов системы, помещенных в газовую фазу; F_,s  свободной энергии при образовании полости в растворителе и заполнении ее молекулой хроматографируемого соединения; N  число Авогадро; R  газовая постоянная; T  температура; P₀  давление в колонке; _s  дипольный момент сорбата; А  изменение величины неполярной поверхности при сорбции;   поверхностное натяжение подвижной фазы; k^e  параметр, учитывающий отличие поверхности полости от плоской поверхности; _s  объем молекулы сорбата; V  мольный объем подвижной фазы.

Теория предполагает, что объем ассоциата сорбатсорбент _s,s пропор­ционален объему молекулы сорбата:

_s,s =  _s , (31)

где   коэффициент пропорциональности.

Параметры P и D уравнения (30) определяются следующими соотношениями:

(32)

, (33)

где ₀  диэлектрическая проницаемость; _s  поляризуемость молекулы сорбата.

Уравнение (30) выведено с учетом следующих допущений:

 F_, определяется только ван-дерваальсовыми взаимодействиями;

 молекулы растворителя, сорбата, неподвижной фазы, а также ассоциаты сорбатсорбент имеют сферическую форму;

 молекулы растворителя намного меньше молекул неподвижной фазы, а последние намного крупнее молекул сорбатов;

 давление равно 1 атм;

 подвижная фаза несжимаема.

Однако, несмотря на достаточно детальное физическое описание процессов, протекающих при обращенно-фазовой хроматографии, полностью теоретический расчет удерживания  конечная цель хроматографической теории  остается практически неразрешимой задачей. Трудности такого расчета связаны как с неопределенностью некоторых параметров, так и с отклонениями реальных систем от допущений, сделанных при выводе уравнения (30). До сих пор неизвестны примеры априорного расчета параметров удерживания исходя из свойств сорбатов и других компонентов системы. В то же время анализ многочисленных экспериментальных закономерностей обращенно-фазовой хроматографии показывает правильность основных выводов этой теории.

Так, например, согласно уравнению (30), при постоянных условиях хроматографирования удерживание различных сорбатов определяется следующими факторами: дипольным моментом сорбатов, объемом их молекул, поляризуемостью, уменьшением площади неполярной поверхности при сорбции.

Числовые значения этих параметров, а также коэффициентов уравнения (30) известны далеко не в полном объеме. Поэтому прямое использование данного уравнения для расчета удерживания невозможно. Выявление роли упомянутых факторов служит основой для различных моделей удерживания, связывающих коэффициенты емкости с доступными параметрами или физико-химическими свойствами сорбатов.

Систематическое исследование удерживания обычно проводят в таких условиях, когда максимальное число параметров уравнения (30) сохраняют постоянное значение. При этом решается задача интерпретации и прогнозирования не абсолютных, а относительных величин удерживания в рамках определенных классов веществ. Этот подход, являющийся вынужденным, в то же время служит единственной тактикой исследований, приводящей к важным результатам. Создаваемые таким образом модели удерживания имеют большое практическое значение при выборе условий разделения.

Подобный же подход используется для оценки влияния на удерживание состава подвижной фазы и структуры сорбента.

Оценка влияния состава элюента на коэффициент емкости непосредственно по уравнению (30) по указанным выше причинам невозможна. Практически при измерении коэффициентов емкости нецелесообразно выходить за пределы 1 k  20. В этих пределах для оценки влияния состава элюента на удерживание используют полуэмпирическое уравнение

lg k = lg k_w - m C , (34)

где k_w  коэффициент емкости, экстраполированный к нулевому содержанию органического растворителя в подвижной фазе. Данное уравнение хорошо описывает экспериментальны данные, а его коэффициенты определяют экспериментально. Теоретический расчет этих коэффициентов с помощью уравнения (30) практически невозможен из-за неопределенности многих параметров.

Другой подход к описанию зависимости удерживания от концентрации органического растворителя в элюенте основан на гипотезе о сольватации сорбата и сорбента. Предположим, что:

1. молекула сорбата Х в растворе сольватирована n молекулами органического растворителя (XB_n);

2. неподвижная фаза сольватирована m молекулами органического растворителя (SB_m);

3. при сорбции часть сольватирующих молекул растворителя B высвобождается в подвижную фазу.

Соответствующее уравнение тогда может быть записано в виде

XB_n + SB_m = XSB_m+np + pB , (35)

где XSB_m+np  сорбированный комплекс; p  число молекул растворителя B, высвобождающееся при сорбции.

Константа равновесия может быть найдена как

. (36)

Коэффициент емкости определяется как произведение коэффициента распределения на фазовое отношение:

, (37)

Подставив (36) в (37), получим

; (38)

. (39)

Считая, что при достаточно большой концентрации органического растворителя величины [SB_m] и V_s/V_m постоянны, получим линейное уравнение

, (40)

где p имеет ясный физический смысл  число молекул органического растворителя, вытесняемое с поверхности сорбента одной молекулой сорбата, а коэффициент b соответствует логарифму коэффициента емкости при концентрации органического растворителя 1 моль/л. Подчеркнем, что по определению константы равновесия в уравнении (36) используется не объемная, молярная концентрация растворителя B.