2. Высокоэффетивная жидкостная хроматография

2.1. Общие сведения о высокоэффективной жидкостной хроматографии и классификация ее видов

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - это современ­ная форма реализации классической колоночной жидкостной хроматографии (ЖХ), которой присущи:

 высокая скорость и селективность разделения;

 минимальная степень размывания хроматографических зон, что позволяет разделять соединения, лишь незначительно различающиеся по константам сорбции;

• высокая степень автоматизации разделения и обработки информации.

Перечисленные достоинства превратили ВЭЖХ в мощнейший из современных методов анализа сложных смесей.

Колоночная ЖХ была предложена М.С. Цветом в 1903 г. для разделения хлорофилловых пигментов. Однако долгое время она не получала нужного аппаратурного оформления и не находила применение в аналитической химии. Лишь с середины 60-х годов прошлого столетия появились проточные высокочувствительные ультрафиолетовый, рефрактометрический и электрохимический детекторы, а также насосы, обеспечивающие строго постоянную скорость потока элюента при высоких давлениях на входе в колонку. На базе этих достижений были сконструированы жидкостные хроматографы.

В обычной ЖХ разделение смеси проводят в довольно длинных (10 - 100 см) колонках диаметром 1 - 2 см, заполненных сорбентом с диаметром зерен 160 - 250 мкм. В современной ВЭЖХ применяют колонки диаметром 1 - 3 мм, длиной 50 - 200 мм (иногда микроколонки), заполненные сорбентом с диаметром частиц 5-20 мкм. Очень плотное заполнение колонки таким сорбентом позволяет резко увеличить эффективность разделения сложных смесей, которая практически не уступает эффективности капиллярной газовой хроматографии и достигает 1000 и более тарелок за счет развития поверхности раздела фаз. Плотность заполнения обычно должна быть такой, чтобы обеспечить перепад давления в колонке 20 - 50 (иногда и более) атм. Для достижения высокой скорости элюирования емкость разделительной колонки должна быть невысокой.

В газовой хроматографии элюент - инертный газ практически не влияет на параметры удерживания, так как не изменяет адсорбционного равновесия. В жидкостной хроматографии элюент обычно участвует в адсорбционных процессах, идет конкурентная адсорбция. Поэтому, меняя природу элюента, можно добиваться очень хорошей селективности разделения близких по природе сорбатов. Селективность можно значительно повысить, используя градиентное элюирование, т.е. изменяя в ходе хроматографирования природу элюента или концентрацию элюирующего раствора.

Область применения ВЭЖХ значительно шире, чем газовой хроматографии, поскольку большинство природных и синтетических веществ нельзя перевести в газовую фазу. В последние годы аналитическая ЖХ в различных ее вариантах развивается очень быстро. Однако молекулярная теория ЖХ, как и молекулярная теория адсорбции из растворов, еще не разработана. Причиной этого является сложность системы и необходимость учета межмолекулярного взаимодействия молекул всех компонентов раствора не только с адсорбентом, но и друг с другом, причем находящихся как в адсорбированном состоянии, так и в растворе. Поэтому большое значение имеет установление качественных связей между параметрами удерживания и структурой молекул дозируемых компонентов, химией поверхности адсорбента и природой элюента. Эти связи отражают межмолекулярные взаимодействия в системе дозируемое вещество - элюент - адсорбент, позволяют понять характер этих взаимодействий и оптимизировать условия хроматографирования.

Существует много вариантов ВЭЖХ, для которых может быть предложена следующая классификация:

— нормально-фазовая хроматография - такой вариант ВЭЖХ, когда подвижная фаза менее полярна, чем неподвижная, а основной фактор, определяющий удерживание, - это взаимодействие сорбатов с поверхностью сорбента;

— обращенно-фазовая хроматография - такой вариант ВЭЖХ, когда подвижная фаза более полярна, чем неподвижная, и удерживание определяется непосредственным контактом молекул сорбата с поверхностью или объемом сорбента;

— ионообменная хроматография - вариант, при котором сорбция осуществляется путем обмена ионов неподвижной фазы на ионы хроматографируемых веществ (аналогично можно определить лиганднообменную хроматографию);

— хроматография на динамически модифицированных сорбентах - вариант ВЭЖХ, при котором сорбат не взаимодействует непосредственно с поверхностью сорбента, а вступает в ассоциацию с молекулами приповерхностных слоев элюента. Состав этих слоев, находящихся в динамическом равновесии с подвижной фазой, отличается от среднего состава подвижной фазы;

— ион-парная хроматография – вариант обращенно-фазовой хроматографии ионизированных соединений, при котором в подвижную фазу добавляется гидрофобный противоион, качественно изменяющий сорбционные характеристики системы;

¾ эксклюзионная хроматография - способ разделения соединений по их молекулярным массам, основанный на различии в скорости диффузии в порах неподвижной фазы молекул различных размеров.