1. Методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов. Техника посева

Рассев шпателем по Дригальскому.

Техника посева. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й - минимальное. Этот метод применяется для получения изолированных колоний и чистой культуры микроорганизма.

• Рассев петлей по Дригальскому (посев штрихами).

Техника посева. Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый материал петлей вносят в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии.

• Метод фильтрации.

Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделение содержащихся микроорганизмов по величине.

Этот метод применяется для очистки вирусов от бактерий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).

2. Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов

• Метод Шукевича.

Техника посева. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды дают «ползущий» рост по скошенному агару. Для получения чистой культуры ее отсевают с верхнего края посева.

• Метод прогревания. Позволяет отделить спорообразующие бациллы от не споровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 мин. Вегетативные формы погибают, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают.

• Бактериостатический метод (метод ингибирования). Основан на избирательном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Например, антибиотики позволяют очистить исследуемый вируссодержащий материал от сопутствующей бактериальной флоры. Серная кислота (5% р-р) быстро убивает большинство бактерий, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях.

Метод заражения лабораторных животных или растений. Применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделения их от сапрофитной флоры. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных или сорта растений.

После появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении в изучении облигатных паразитов этот метод является основным и единственным

Самостоятельная работа: апробировать различные методы посевов:

Название	Рисунок	Значение
Седиментации по Коху
Посев по Дригальскому
Посев по Шукевичу
Методом укола
Посев по МПБ

Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 2. Биохимическая активность аэробов (дифференциально-диагностические признаки)

а) Сахаролитическая и протеолитическая активность

Цель: изучить ферментативную активность микроорганизмов.

Теоретическая справка

Ферментативная активность микроорганизмов

Для обнаружения ферментов исследуемую культуру микробов засевают на дифференциально-диагностические питательные среды, которые в зависимости от состава и своего назначения можно разделить на 4 группы.

• Среды с сахарами или многоатомными спиртами, для определения сахаролитической активности микроорганизмов.

• Среды, содержащие белковые вещества (желатину, молоко, свернутую сыворотку крови, куриный белок и т. д.) для выявления протеолитических ферментов.

• Среды с химическими веществами, изменяющимися под влиянием окислительно-восстановительных ферментов, продуцируемых микробами.

• Среды, содержащие индифферентные химические вещества, являющиеся источником питания одних видов и не ассимилируемые другими видами микробов.

В состав дифференциально-диагностических сред обычно вводят индикатор, указывающий на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента.

Свойство расщеплять углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим патогенным микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий «сахара» расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются газообразные вещества.

Сахаролитические свойства, т. е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа

Эти свойства изучают на:

• жидких и полужидких средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды, поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скоплению его в «поплавке» на жидких средах.

• на плотных средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы сбраживают до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу) и образуют окрашенные колонии - кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

• на средах с крахмалом (среда Кодама) определяют микроорганизмы, образующие амилазу. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя, - цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

• молоко при росте микроорганизмов, сбраживающих лактозу, свертывается.

• среда Вильсон-Блера. Готовят из мясо-пептонного агара, к которому добавляют глюкозу, Na₂S0₄, хлористое железо FeCl . На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. Рост происходит в глубине агара При этом осуществляется восстановление сернистокислого натрия до сернистого, последний же вступает в реакцию с хлорным железом, переводя его в сернистое железо, имеющее черный цвет. Разрыв питательной среды связан с расщеплением глюкозы до газа.

Микротест - системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально- диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Протеолитические свойства - с пособность расщеплять белки изучают:

• на средах с желатином. В некоторых бактериях (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и т. д.) протеолитический фермент выявля­ется путем разжижения желатины.

• на средах с молоком. Микроорганизмы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока - оно приобретает вид молочной сыворотки.

• на средах с пептоном. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образования определяют с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают полосками и, после посева культуры на МПБ, помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной раствором, содержащим ацетат свинца, бикарбонат натрия, происходит образование сульфата свинца - бумажка чернеет; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты.

Гемолитические свойства микроорганизмов изучают на питательных средах с добавлением эритроцитов (кровяной МПА - для культивирования аэробов, среда Цейсслера - для культивирования анаэробов). На плотных средах вокруг колоний появляется прозрачная зона гемолиза.

Самостоятельная работа: изучить ферментативную активность неизвестной культуры результаты внести в таблицу, определить вид возбудителя, пользуясь таблицей «Биохимическая активность микробов».

БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРОБОВ

Вид м/о	Сахаролитическая					Протеолитическая
	лактоза	глюкоза	мальтоза	маннит	сахароза	индол	Н2S

Б) Каталазная активность аэробов

Цель: изучить каталазную активность микроорганизмов.

Теоретическая справка

Каталазная активность. Каталаза - это фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1% раствором перекиси водорода. На предметное стекло помещают кашпо перекиси водорода и суспензируют в ней небольшое количество культуры микроорганизмов, выращенной на плотной среде

Самостоятельная работа: определить тип дыхания исследуемой культуры.

Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Подпись преподавателя________________________________________________________

ЗАНЯТИЕ №8

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ (ПРОДОЛЖЕНИЕ). ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АНАЭРОБОВ И ИХ ИДЕНТИФИКАЦИЯ.

Цель занятия:

изучить методы выделения чистых культур анаэробов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Виды энергетического метаболизма.

2. Способы получения энергии бактериями (дыхание, брожение).

3. Типы дыхания бактерий.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

• идентифицировать микроорганизмы.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ

• о методах культивирования анаэробов

Выполните задания для самоконтроля:

Культуральные свойства микроорганизмов__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Характеристика роста микроорганизмов на плотных питательных средах____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Характеристика роста микроорганизмов на жидких питательных средах____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа №1. Методы создания анаэробных условий

Цель: изучить методы создания анаэробных условий.

Теоретическая справка

Методы создания анаэробных условий