2.3. Дослідження ентомопатогенної активності штаму Bacillus thuringiensis ону 15

Для дослідження ентомопатогенних властивостей штаму Bacillus thuringiensis. ОНУ 15 у 24 стерильні чашки було внесено диски фільтрувального паперу, змочені стерильною водою. У кожну з чашок було покладено по 5 - 6 зерен міцелію гливи. Після цього чашки на три доби було розміщено для пророщення гриба у вологому середовищі при температурі 22 ^оС. Для зберігання постійної вологості чашки раз на добу обприскували стерильною водою у боксі.

Після цього для експерименту було відібрано 180 личинок грибного комарика Bradisia pilistrata, у зв’язку з тим, що саме ця комаха є типовим тест-об’єктом для встановленя ентомоцидної дії комерційних препаратів, окрім цього вона не вимоглива до умов вирощування.

Відбиралися комахи за середнім розміром 3 - 5 мм (відносно молоді особини). Критерії відбору личинок полягали у тому, що б перенесені у чашки личинки були за розвитком на стадії харчування та підготовлення до переходу у стан куколки, у зв’язку з тим, що безпосередньо перед окуклюванням личинка перестає харчуватися, та вже не зможе інфікуватися бактерією-збудником і її кристалом [17].

По 15 відібраних личинок було внесено у чашки з пророщеним грибом. Після цього було проведено обробку чашок суспензією експериментального штаму різних термінів культивування (добовою, тридобовою, п’ятидобовою суспензіями). Суспензії доводили до єдиної концентрації у п’ять одиниць за стандартом каламутності. Обприскування проводили за допомогою аерозольного оприскувача у обсязі 1 мл на чашку. На протязі 11 днів проводили нагляд за чашками, реєструючи появу дорослих особин.

Для обробки статистичних даних враховувалися показники появлення імаго особин та загибель личинок, які реєструвалися кожного дня на протязі всього періоду спостереження.

Для підтвердження факту, що загибель личинок спричинена саме досліджуваним штамом, нами було проведено встановлення наявності контамінування личинок бактеріями Bacillus sp ОНУ 15.

Для цього у стерильних умовах з усіх чашок, включаючи контрольні зразки, були відібрані загиблі личинки та перенесені у заздалегідь марковані пробірки. Тільця личинок були обережно перетерті у гомогенат з додаванням 10 мл фізіологічного розчину. Після цього 0,1 мл цього гомогенату було посіяно у чашки з МПА. Культивували протягом однієї доби при температурі 28 ^оС.

З колоніями, що виросли, було проведено ідентифікаційні тести для встановлення їх приналежності до дослідного штаму:

- візуальна оцінка колоній;

- мікроскопічні методи;

- біохімічні тести;

Колонії, отримані з личинок, було виділені у чистій культурі, з їх використанням було проведено повторне зараження нових, заздалегідь відібраних личинок. Цей тест проходив за тією ж методикою як і попередній, та дозволяв нам встановити підвищення вірулентності ентомопатогенного штаму Bacillus thuringiensis ОНУ 15 за допомогою пасажу через сприйнятливий організм [17, 33].

Обробку даних, отриманих на протязі досліду, проводили за допомогою методів статистичного аналізу. Для встановлення достовірності даних, нами були підраховані показники стандартного відхилення для середніх показників смертності личинок у чашок обприсканих суспензіями культур різного терміну культивування. Це робилося за допомогою серії формул для підрахунку стандартного відхилення [2, 26]:

1. , де

ā – середнє арифметичне всіх показників

а_n– показники

2. , де

Е – середньоквадратична помилка

n – кількість врахованих повторностей

Для порівняння інсектицидної активності досліджуваної бактерії у різних чашках підраховували відсоток смертності личинок в дослідних та контрольних варіантах. Розрахунки здійснювали за формулою Еббота [2]:

Е= (А – В) / (100 – В) х 100 % , де

Е — ефективність в % (з поправкою на контроль)

А — відсоток смертності в досліді;

В — відсоток смертності в контролі;

Для встановлення достовірності показників використовували коефіцієнт Стьюдента, який визначається за наступнми формулами [2, 26]: