Література

1. Гонський я.І., Максимчук т.П. Біохімія людини. Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. – 736с.

2. Губський ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508с.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744с.

   Заняття №5

   Тема: ШВИДКІСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНИХ РЕАКЦІЙ. одиниці активності ферментів.

Актуальність теми: Знання кінетики ферментативних процесів має важливе значення для розуміння принципів застосування ензимів у клінічній практиці.

Навчальні цілі:

Знати: залежність швидкості ферментативних процесів від температури, рН середовища, концентрації ферменту і субстрату.

Вміти: провести дослідження активності аспартатамінотрансферази і трактувати одержані дані.

Самостійна позааудиторна робота

В зошитах для протоколів:

1. намалюйте графіки залежності швидкості ферментативної реакції від концентрації ферменту і субстрату.

2. підготуйте вихідні дані для оформлення протоколу лабораторної роботи „Визначення активності аспартатамінотрансферази”.

Контрольні питання

1. Кінетика ферментативних реакцій.

2. Оптимальні умови для визначення активності ферментів.

3. Методи визначення та вираження активності ферментів.

Самостійна аудиторна робота

Дайте відповідь на поставлені запитання

1 Як залежність швидкість ферментативних реакцій від:

а) концентрації ферменту,

б) концентрації субстрату,

в) температури,

г) рН середовища.

2.Виконати лабораторну роботу „Визначення активності аспартатамінотрансферази” і захистити протокол.

Принцип методу. В результаті переамінування під дією аспартатамінотрансферази (АсАТ) аспарагінова кислота перетворюється в щавелевооцтову (ЩОК). ЩОК здатна в процесі ферментативної реакції перетворюватися в піровиноградну кислоту (ПВК). При додаванні кислого 2,4-динітрофенілгідразину (2,4-ДФГ) ферментативний процес зупиняється і утворюється динітрофенілгідразин піровиноградної кислоти, який в лужному середовищі дає коричнево-червоне забарвлення, інтенсивність якого пропорційна кількості утвореної ПВК. Таким чином, по кількості утвореної ПВК можна судити про активність ферменту. Активність амінотрансфераз виражають в мікромолях ПВК, утвореної 1 мл сироватки крові за 1 годину інкубації при температурі 37^оС. В нормі активність АсАТ сироватки крові становить 0,1-0,45 мкмоль/год х мл.

Хід роботи.

В дві пробірки (дослідну і контрольну) вносять по 0,5 мл субстратної суміші для визначення АсАТ і ставлять в термостат при 37^оС на 5 хвилин. Потім в дослідну пробірку додають 0,1 мл сироватки крові, а в контрольну - 0,1 мл води і 0,5 мл р-ну 2,4-ДФГ. Ставлять обидві пробірки в термостат на 60 хвилин при температурі 37^оС. Виймають пробірки, додають в дослідну пробу 0,5 мл розчину 2,4-ДФГ і залишають при кімнатній температурі на 20 хвилин. Далі додають по 5 мл 0,4 н розчину NаОН в кожну пробірку, ретельно перемішують і залишають при кімнатній температурі на 10 хв для розвитку забарвлення. Оптичну густину вимірюють на ФЕКу в кюветі на 10 мм при зеленому світлофільтрі (500-560 нм) проти контролю.

Розрахунок активності ферменту виконують по приготовленому заздалегідь калібрувальному графіку (за допомогою стандартного розчину ПВК). Активність виражають в умовних одиницях з розрахунку на 1 мл сироватки. 1 одиниця АсАТ відповідає такій активності ферменту, яка здатна за даних умов утворювати 1 мкг ПВК. При обчисленні ферменту необхідно врахувати і розведення сироватки:

Х = А х 10, де

Х – одиниця активності ферменту;

10 - перерахунок на 1 мл;

А - кількість ПВК в 0,1 мл сироватки, знайдена по калібрувальному графіку, мкг.

У сироватці крові здорових людей активність АсАТ, визначена при допомозі даного методу, коливається від 8 до 40 од. Перерахунок активності ферменту в мікромолі ПВК, що утворилася при інкубації 1 мл сироватки протягом 1 години при 37^оС, проводять за формулою:

А х 10

АсАТ = --------- , де

88

А – кількість ПВК в 0,1 мл сироватки, знайдена по калібрувальному графіку, мкг;

88 - маса 1 мкмоль ПВК, мкг;

10 - коефіцієнт перерахунку на 1 мл сироватки.